腫瘤靶向熒光小分子IR-780衍生物的合成、鑒定及生物學活性的實驗研究.pdf

1、研究背景與目的
　　盡管近幾十年來人們對腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等機制研究獲得了重要進展,但由于仍缺乏靈敏的早期診斷、高特異性的靶向治療以及實時有效的治療監(jiān)測,惡性腫瘤依然是目前嚴重威脅人類健康的重大疾病。腫瘤診斷治療學(Tumor theranostics)是近些年提出來的一種腫瘤診治新策略,其核心是將腫瘤治療與實時顯影有效結(jié)合,引導醫(yī)生及時調(diào)整治療方案,提高腫瘤病人的生存率和生活質(zhì)量,為腫瘤個體化治療提供一種新途徑。由于制備同時具

2、有腫瘤特異顯影與靶向治療作用的診斷治療劑(Theranostic agents)是同步實現(xiàn)腫瘤診斷與治療的重要途徑,因此近兩年就該類多功能抗腫瘤藥物的研發(fā)已成為繼分子靶向藥物后的新研究熱點。
　　目前對于診斷治療劑的制備主要是通過兩種策略:一是通過多步化學連接策略,將腫瘤靶向配體,如葉酸、多肽、抗體、核酸適配體等,分別與造影劑和抗腫瘤藥物進行連接,從而同時實現(xiàn)腫瘤靶向顯影與治療作用;另一種是基于納米材料的特殊性質(zhì),如利用尺寸依賴性

3、的腫瘤組織增透與阻滯(EPR)效應,或利用其比表面積大,易于表面修飾各種靶向配體的優(yōu)點,實現(xiàn)腫瘤藥物的被動或主動靶向遞送,同時利用納米材料自身顯影特性或進一步偶聯(lián)顯影劑,實現(xiàn)腫瘤的靶向顯影與治療監(jiān)測。通過上述兩種策略,目前已經(jīng)獲得了一些具有潛在應用價值的診斷治療劑。例如,99mTc標記的阿霉素脂質(zhì)體已經(jīng)在進入I期臨床試驗,用于頭頸鱗癌病人的治療與監(jiān)測。
　　然而,通過多步化學連接策略制備診斷治療劑,可能會導致腫瘤配體靶向性的降低、

4、顯影劑成像能力的減弱,甚至藥物抗腫瘤活性的喪失。此外,多步化學反應與分離純化,還可能增加制備成本。特別是基于多功能納米材料策略制備的診斷治療劑,容易在內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng),例如肝脾等組織器官沉積,存在制備復雜、成本較高、潛在毒性等缺點,其應用也受到了很大限制。因此,優(yōu)化診斷治療劑的制備方法,或發(fā)展新的制備策略具有重要研究意義。
　　七甲川花菁類化合物是一類兩端氮雜環(huán)中間含有多個次甲基長共軛鏈的花菁小分子,其具有摩爾吸光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率

5、高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點,作為近紅外熒光探針,已經(jīng)被廣泛應用于蛋白與核酸標記、基因測序、動物活體成像以及臨床造影等。其中,代表性分子吲哚菁綠(ICG),已經(jīng)在臨床上廣泛用于心臟、肝臟、眼底血管顯影等。最近,我們課題組首次報道七甲川花菁熒光小分子IR-780,不需要化學連接腫瘤靶向配體,即在多種腫瘤細胞及其荷瘤模型上顯示出良好的腫瘤靶向近紅外熒光顯影特性。進一步亞細胞器共定位實驗結(jié)果表明, IR-780選擇性蓄積在腫瘤細胞的線粒體內(nèi),其親脂性離

6、域型陽離子特性可能與其靶向腫瘤細胞線粒體密切相關(guān)。
　　由于IR-780具有良好的腫瘤選擇性和近紅外熒光顯影特性,其也為腫瘤靶向診斷治療藥物的研究提供了新的思路和途徑?；谡n題組前期研究基礎,本研究設想:(1) IR-780能否作為抗腫瘤藥物的新型靶向載體,即通過化學連接策略,將抗腫瘤藥物與IR-780進行共價連接,能否獲得同時具有腫瘤靶向近紅外顯影與治療作用的多功能化合物?(2)能否不經(jīng)過化學連接抗腫瘤藥物策略,直接通過對 IR

7、-780分子結(jié)構(gòu)進行修飾,通過類似物的合成與篩選,獲得自身同時具有腫瘤靶向顯影與治療作用的新型多功能診斷治療劑,為腫瘤診斷治療劑探索新的制備策略,為腫瘤個體化治療提供新途徑。
　　研究方法與結(jié)果
　　為了驗證上述假設,獲得同時具有腫瘤靶向、近紅外熒光顯影與治療作用的多功能七甲川花菁分子,本論文分三個部分開展研究,主要結(jié)果如下:
　　1. IR-780羧基衍生物IR-808的合成及腫瘤近紅外熒光顯影特性的鑒定
　　

8、1.1首先建立并優(yōu)化了該類七甲川花菁類熒光小分子的合成方法,分別對合成該類七甲川花菁熒光小分子需要的三步反應,即Vilsmeier-Haack甲?；?、N-烷基化、縮合反應進行了改進。與以往文獻中報道的常用合成方法相比,新建立的合成方法具有高效簡潔、易大量制備等優(yōu)點,為大量合成七甲川花菁熒光小分子、進一步化學修飾與藥物連接奠定了基礎。
　　1.2衍生合成了含有羧基官能團的IR-780衍生物—IR-808。鑒于IR-780缺乏可供直接

9、化學連接抗腫瘤藥物的活性反應官能團,需要對其進行結(jié)構(gòu)修飾。本研究以6-溴己酸為原料,在合成IR-780的反應原料中引入羧基活性反應官能團,成功合成了含有兩個羧基活性反應官能團的 IR-780衍生物 IR-808,并經(jīng)過核磁共振氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)、高分辨質(zhì)譜(HRMS)測試確證其結(jié)構(gòu)。
　　1.3 IR-808腫瘤靶向近紅外熒光顯影特性的鑒定。經(jīng)光譜測試發(fā)現(xiàn),IR-808的最大吸收和發(fā)射波長均在700-90

10、0 nm近紅外光譜區(qū),具有近紅外顯影特性和良好的血清穩(wěn)定性。體內(nèi)實驗表明,IR-808在rTDMCs、HeLa及LCC三種腫瘤細胞動物荷瘤模型中均顯示出較好的腫瘤靶向性,提示其用于腫瘤特異性顯影與診斷具有潛在應用前景。研究結(jié)果表明,IR-808不僅保留了良好的腫瘤靶向近紅外熒光顯影特性,同時還引入了兩個可供化學連接反應的羧基官能團,為進一步化學修飾、藥物連接,或放射性核素標記等奠定了基礎;為獲得同時具有腫瘤靶向顯影與治療作用的多功能分子

11、,或經(jīng)放射性核素等標記后用于深部組織腫瘤成像與診斷提供了可能性。
　　2. IR-808與抗癌藥物的化學連接及其腫瘤顯影和殺傷活性的實驗研究
　　2.1成功地將 IR-808與臨床上常用的三種抗腫瘤藥物進行了共價連接。利用IR-808具有羧基活性反應官能團的結(jié)構(gòu)特性,選擇臨床上常用的分子量小、抗瘤譜廣、活性強但選擇性差的抗腫瘤藥物,包括美法侖(Melphalan)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、阿霉素(DOX),分別與IR-80

12、8進行化學連接,獲得與美法侖的連接物IR-808NM,與5-Fu的連接物IR-808-5Fu以及與阿霉素的共價連接物IR-808DOX。前兩者獲得純品化合物,其結(jié)構(gòu)經(jīng)過1H NMR及HRMS測試所確定。后者經(jīng)HRMS測試證明阿霉素與IR-808連接成功,但經(jīng)反復優(yōu)化反應與純化條件,未獲得純品IR-808DOX。
　　2.2對新合成的共價連接產(chǎn)物進行腫瘤顯影與殺傷活性的評價。通過上述化學連接策略,將 IR-808成功與抗腫瘤藥物連接

13、并獲得純品的新共價連接物 IR-808NM、IR-808-5Fu分別進行評價。結(jié)果表明, IR-808NM保留較好的腫瘤靶向特性,但IR-808-5Fu則失去了腫瘤靶向性。進一步應用 MG63骨肉瘤細胞和 SW480結(jié)腸癌細胞進行 IR-808NM的抗腫瘤活性評價。結(jié)果顯示,IR-808NM對兩種細胞的生長抑制活性顯著高于對照藥美法侖。因此,通過化學連接策略,本研究成功獲得了同時具有腫瘤靶向顯影與治療作用的新型多功能熒光小分子IR-80

14、8NM,驗證了IR-780類似熒光小分子可作為抗腫瘤藥物靶向載體的設想。
　　3. IR-808酯化衍生物的合成與抗腫瘤活性研究
　　鑒于我們的研究和相關(guān)文獻報道 IR-780和某些花菁類分子在較高劑量時可表現(xiàn)出一定的線粒體毒性,本研究提出,通過對IR-808進行酯化衍生化,以提高親脂性,使其更容易跨過磷脂雙層疏水性的線粒體膜,從而增大其在線粒體的濃度及毒性,可望獲得不需要化學連接抗腫瘤藥物,自身具有腫瘤靶向、近紅外熒光顯影

15、與抗腫瘤活性的新型多功能小分子。
　　3.1 IR-808酯化衍生物的高效合成及其近紅外熒光顯影特性的鑒定。為了提高IR-808親脂性,顯著增強其進入細胞及其線粒體的濃度與毒性,在IR-808的基礎上,設計合成四個IR-808親脂性強的酯化衍生物,包括丁酯(IR-808DB)、己酯(IR-808DH)、環(huán)己酯(IR-808DCH)、苯酚酯(IR-808DP),均為全新結(jié)構(gòu)的化合物,未見文獻報道。所建立的合成方法具有高效、易于大量制

16、備等優(yōu)點。四種 IR-808酯類衍生物在甲醇、DMSO、血清中的最大吸收和發(fā)射波長均在近紅外區(qū)域,具有比ICG更高的摩爾吸光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率。
　　3.2篩選獲得IR-808DB具有顯著抗腫瘤活性。應用人肺癌細胞(A549)研究發(fā)現(xiàn), IR-808丁酯衍生物(IR-808DB)具有最顯著的抗腫瘤活性(IC50值為0.43μM)。進一步在乳腺癌細胞(MDA231、MCF-7)、肝癌細胞(SMMC-7721, HepG2)、肺癌細胞

17、(NCIH-460)等多種人類腫瘤細胞模型中評價其抗腫瘤活性,結(jié)果顯示 IR-808DB分子對多種腫瘤細胞均具有顯著的生長抑制作用(IC50<6μM)。通過荷瘤動物體內(nèi)研究,發(fā)現(xiàn)IR-808DB在 rTDMCs、Lewis、HeLa以及 A549等四種腫瘤模型上,均顯示出較強的抗腫瘤活性。以20mg/kg臨床藥物環(huán)磷酰胺(CTX)為陽性對照,發(fā)現(xiàn)5mg/kg IR-808DB可以明顯抑制腫瘤的生長。治療過程中,荷瘤動物的重量和生理狀態(tài)未

18、見明顯異常,主要臟器的組織切片未見明顯病理改變。此外,通過荷瘤動物體內(nèi)研究,比較 IR-808DB和新合成的共價連接物 IR-808NM的抗腫瘤活性,還發(fā)現(xiàn) IR-808DB的抗腫瘤活性顯著高于IR-808NM。
　　3.3 IR-808DB具有良好的腫瘤靶向顯影特性。近紅外熒光活體成像顯示, IR-808DB在大鼠 rTDMCs荷瘤模型上顯示出腫瘤靶向特性;離體臟器和腫瘤組織的近紅外熒光成像進一步證實其在腫瘤組織的選擇性蓄積。研

19、究還表明,在荷瘤第4天肉眼未見明顯腫瘤包塊形成時,荷瘤部位即可顯示出近紅外熒光顯影;當肉眼可見小于0.5cm的腫瘤包塊形成時,荷瘤部位即具有顯著的近紅外熒光顯影特性,提示IR-808DB在腫瘤早期識別與診斷中可能具有研究價值。
　　結(jié)論與創(chuàng)新
　　本研究首先建立并優(yōu)化了IR-780多種衍生物的化學合成方法,制備了含有羧基官能團的IR-808,證明其具有良好的腫瘤靶向近紅外熒光顯影特性,為連接抗腫瘤藥物或放射性核素等顯影劑,制

20、備可用于深部組織腫瘤成像和具有腫瘤治療作用的多功能分子奠定了基礎。進而,利用IR-808具有羧基活性反應官能團的結(jié)構(gòu)特性,成功地與三種抗腫瘤藥物進行共價連接,篩選獲得了同時具有腫瘤靶向顯影與殺傷作用的衍生物IR-808NM,驗證了IR-780類似熒光小分子可作為抗腫瘤藥物靶向載體的設想。最后,通過對IR-808進行酯化修飾,提高其親脂性,從而增強其線粒體毒性,制備獲得了不需要化學連接抗腫瘤藥物,自身具有腫瘤靶向、近紅外熒光顯影與抗腫瘤活