七十味珍珠丸對苯妥英鈉造成大鼠頂葉、海馬神經(jīng)元凋亡的影響及Bcl-2、Bax的表達.pdf

1、目的:癲癇，一種古老的常見疾病，是由腦部神經(jīng)元的高度同步化異常放電所致的慢性腦部疾病。臨床治療中對于無明確病因或雖有病因卻不能根治者仍主要考慮抗癲癇藥物（Antiepilepticdrugs，AEDs）治療。在眾多AEDs中，苯妥英鈉(PhenytoinSodium，PHT)由于其半衰期長、無鎮(zhèn)靜副作用、價格低廉等原因仍作為多種癲癇類型治療首選藥物之一。但由于其治療譜狹[1]（約10-20ug/ml）且個體差異性大，故在臨床治療中極易出

2、現(xiàn)多個系統(tǒng)的毒副作用。在神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)中主要表現(xiàn)在小腦前庭功能障礙、周圍神經(jīng)系統(tǒng)損害、錐體外系功能障礙、PHT腦病、高顱壓、意識障礙、植物神經(jīng)功能紊亂等多個方面[2]。同時藏藥七十味珍珠丸（Rannasangpei，RNSP）由于其具有鎮(zhèn)靜抗驚厥，促進神經(jīng)元修復(fù)保護，降低腦損傷后NA、β-EP、5-HT神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生等作用[3]故臨床上常用于與AEDs協(xié)同治療癲癇。而本實驗旨在通過研究PHT、RNSP與大鼠頂葉、海馬神經(jīng)元凋亡的相關(guān)性來

3、進一步了解PHT的神經(jīng)毒副作用及RNSP對PHT作用后的神經(jīng)元是否產(chǎn)生影響。具體是通過原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)（terminaldeoxynucleotidyltransferse-mediatedbiotinylateddeoxyuridinetriphosphatenickelendlabeling，TUNEL）來檢測各組頂葉、海馬神經(jīng)元的凋亡及用免疫組化檢測各組Bcl-2、Bax蛋白的表達水平。
　　 方法:
　　

4、1分組及給藥:取健康雄性10周齡左右SD(Sprague-Dawley)大鼠40只，實驗大鼠級別為清潔級，重量約200±20g，根據(jù)給藥不同隨機分為NS（生理鹽水）組、RNSP組、PHT組及PHT+RNSP混合組4組，每組10只大鼠:再根據(jù)時間因素10天、20天分為2個亞組，每個亞組5只大鼠。給藥劑量為成人單位體重常規(guī)治療量25倍，具體為NS1ml/100g/d，PHT150mg/kg/d，RNSP250mg/kg/d;方式為一天兩次灌

5、胃器灌胃，分別灌胃10天、20天。
　　 2取材及檢測:取各組大鼠予以水合氯醛腹腔麻醉后，剪開胸腔暴露心臟，灌注針由心尖入針經(jīng)左心室至主動脈，NS沖洗多聚甲醛灌注后取腦組織頂葉、海馬置于多聚甲醛中浸泡固定，24小時后取標本脫水透明包埋切片。通過TUNEL檢測各組凋亡神經(jīng)元凋亡情況并以細胞凋亡率表示各組結(jié)果;通過免疫組化檢測各組神經(jīng)元Bcl-2、Bax蛋白陽性細胞表達情況并以AO值表示各組結(jié)果。
　　 3統(tǒng)計分析:通過SP

6、SS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，本實驗為完全隨機設(shè)計資料的多個樣本均數(shù)比較可使用方差分析，組間均數(shù)比較可使用Dunnett-t檢驗或SNK-q檢驗，Bcl-2蛋白與Bax蛋白間相關(guān)性檢測可用直線相關(guān)分析方法。
　　 結(jié)果:
　　 1、各實驗組中大鼠頂葉神經(jīng)元的凋亡情況:
　　 1.1HE染色:
　　 各藥物組大鼠頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元排列較整齊，僅可見少數(shù)凋亡細胞，呈胞膜皺縮、胞核固縮深染、染色質(zhì)邊集及周圍空泡

7、形成。與NS組比較形態(tài)上無明顯差異。
　　 1.2TUNEL結(jié)果:
　　 NS組可見少數(shù)凋亡細胞，胞核固縮其內(nèi)出現(xiàn)褐色顆?；驁F塊;RNSP組、PHT組、PHT+RNSP混合組可見散在分布凋亡細胞，將組間均數(shù)進行兩兩比較尸值＞0.01，表示各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 1.3Bcl-2及Bax蛋白表達:
　　 Bcl-2蛋白為抗凋亡蛋白，陽性細胞表達為胞漿核膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，呈重染:B;x蛋白為促凋亡蛋白

8、，陽性細胞表達為胞漿呈黃褐色。通過統(tǒng)計標本陽性細胞的平均光密度值即AO值進行組間兩兩比較尸值＞0.01，表示各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2、各實驗組中大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡情況:
　　 2.1HE染色:
　　 NS組大鼠海馬神經(jīng)元排列整齊，細胞輪廓清晰，胞漿紅染胞核藍染，可見少數(shù)凋亡細胞，呈胞膜皺縮、胞核固縮深染、染色質(zhì)邊集及周圍空泡形成。RNSP組僅可見散在分布的幾個凋亡細胞。PHT組凋亡細胞較多，呈神經(jīng)元排

9、列凌亂、胞間距增大、細胞輪廓模糊、胞核固縮深染及周圍空泡形成，其長療程亞組凋亡尤為明顯。PHT+RNSP組凋亡情況介于PHT組、RNSP組之間。
　　 2.2TUNEL結(jié)果:
　　 NS組可見少數(shù)凋亡細胞，RNSP組可見散在分布凋亡細胞，將兩組均數(shù)進行比較P值＞0.01，表示兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PHT組凋亡細胞明顯增多，以長療程PHT組為著;PHT+RNSP混合組凋亡情況一般，與NS組一起進行多樣本均數(shù)兩兩比較均為P

10、＜0.01，表示各組間存在明顯差異。
　　 2.3Bcl-2及Bax蛋白表達:
　　 在Bax蛋白表達中，NS組、RNSP組可見少數(shù)表達陽性細胞;PHT+RNSP組表達陽性細胞增多;PHT組表達陽性細胞最多及著色最強，長療程亞組尤為顯著。在Bcl-2蛋白表達中，各組情況與前述恰好相反。統(tǒng)計各組間陽性細胞AO值并進行兩兩比較，NS組與RNSP組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，余各組間均存在明顯差異。
　　 3、Bcl-2蛋白與

11、Bax蛋白相關(guān)性:
　　 在實驗組大鼠海馬神經(jīng)元中Bcl-2蛋白與Bax蛋白表達呈負相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1、PHT、RNSP及PHT+RNSP組在長短療程因素參與下對正常大鼠頂葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達未產(chǎn)生明顯影響。
　　 2、RNSP組中長短療程亞組對海馬神經(jīng)元凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達均未產(chǎn)生影響:PHT組可明顯引起海馬神經(jīng)元凋亡，Bcl-2蛋白表達減少，