Notch配體Delta-like1、Delta-like4蛋白的表達(dá)及生物活性的測(cè)定.pdf

1、Notch信號(hào)途徑廣泛存在于多種生物體內(nèi)，且進(jìn)化上高度保守，在胚胎發(fā)育、血細(xì)胞發(fā)育及腫瘤形成等多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Notch信號(hào)在造血系統(tǒng)發(fā)育中起著十分重要的作用。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，人造血干/祖細(xì)胞表面存在Notch受體的表達(dá)，而在骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面存在多種Notch配體的表達(dá)，提示Notch信號(hào)途徑可能對(duì)造血干/祖細(xì)胞的自我更新與增殖起到重要作用。有研究表明Notch可以抑制造血干/祖細(xì)胞的分化,但促進(jìn)其增殖。研究還發(fā)現(xiàn)，Notch

2、信號(hào)途徑能使共同淋巴樣前體細(xì)胞向T細(xì)胞方向分化，抑制向B細(xì)胞方向的分化；在外周脾臟B細(xì)胞發(fā)育中，Notch信號(hào)激活使其向邊緣帶B細(xì)胞方向分化。此外，Notch信號(hào)的失調(diào)與血液系統(tǒng)的許多腫瘤相關(guān)，Notch信號(hào)與T細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，Notch在其中起著癌基因的作用。
　　目前體外研究Notch信號(hào)對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的作用多采用Notch配體刺激。Notch配體表達(dá)系統(tǒng)分真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。真核表達(dá)絕大多數(shù)是哺乳動(dòng)物

3、細(xì)胞系，如CHO，COS7等，但由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成本高、難操作、表達(dá)水平低，限制其廣泛應(yīng)用。而原核表達(dá)系統(tǒng)由于沒(méi)有翻譯后加工修飾系統(tǒng)，表達(dá)的真核細(xì)胞蛋白質(zhì)多以包涵體形式表達(dá)，復(fù)性純化方法復(fù)雜。而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有原核生物和真核生物的某些優(yōu)點(diǎn)：有翻譯后加工修飾系統(tǒng)，酵母能在簡(jiǎn)單廉價(jià)的培養(yǎng)基中快速高密度地繁殖，產(chǎn)量高，成本低，可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。因此在選擇Notch配體的表達(dá)系統(tǒng)中我們首先選擇畢赤酵母，其次是原核表達(dá)系統(tǒng)，但需要實(shí)現(xiàn)

4、可溶性表達(dá)，以利于大規(guī)模應(yīng)用。
　　我們主要進(jìn)行了如下幾方面的研究：
　　1、畢赤酵母表達(dá)重組人Delta-like1ext-Fc（hDll1ext-Fc）蛋白。PCR法擴(kuò)增hDll1ext片段,截取已有質(zhì)粒pET32a-Fc中Fc片段，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pPIC9K-hDll1ext-Fc，和pPIC9K-Fc，經(jīng)過(guò)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷，G418抗生素雙重篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。
　　2、重組hDll4的原核表達(dá)。構(gòu)建

5、原核表達(dá)載體pET32a-hdll4ext-26-217和pET32a-hdll4ext-93-217，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG，30℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，鎳離子螯合珠(InvitrogenProBondTM)一步純化上清。
　　3、重組hDll4蛋白生物學(xué)功能的檢測(cè)。通過(guò)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)重組hDll4蛋白的生物學(xué)活性。
　　結(jié)論：實(shí)現(xiàn)了hDll1ext-Fc和人IgG1Fc片段的在畢赤酵母中的表達(dá)；25℃低溫誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)重組h