SDS-PAGE等三種方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌的比較鑒定及類毒素疫苗的初步研究.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的猝死癥，發(fā)病急，死亡快，因此，對疫區(qū)流行的產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素型及時準(zhǔn)確地做出判斷是非常必要的。本研究詳細(xì)介紹了SDS-PAGE的檢測方法，并采用該方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株、德國牛舍環(huán)境氣源性產(chǎn)氣莢膜梭菌20株分離株和山東省部分地區(qū)分離到的57株產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行毒素型的鑒定，并對不同檢測方法的鑒定結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果SDS-PAGE與ELISA的符合率為95％，與多重PCR的符合率為100％。與此同時，SDS-PAGE

2、方法鑒定的過程中提取了大量的外毒素，滅活后制備類毒素疫苗有針對性控制該病的流行和發(fā)生。另外，對產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素的致病性也進(jìn)行了初步研究。 本研究共分為五個部分： 第一部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離和初步鑒定對山東省不同地區(qū)采集的樣品通過純分離培養(yǎng)，需氧及厭氧環(huán)境的對照培養(yǎng)，形態(tài)觀察，API-20A系統(tǒng)生化試驗，牛乳爆裂發(fā)酵試驗，毒素檢查對采集樣品進(jìn)行了分離和初步鑒定。結(jié)果，從298個樣品中最終分離出57株產(chǎn)氣莢膜梭菌。

3、 第二部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素純化過程中硫酸銨沉淀法的改進(jìn)本試驗采用不同飽和度的硫酸銨對產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素蛋白進(jìn)行鹽析，并對粗提的蛋白進(jìn)行電泳，通過電泳后的毒素蛋白條帶及蛋白含量，最終確定60％飽和度的硫酸銨可以有效的沉淀產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素蛋白。 第三部分：SDS-PAGE方法鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株NTCC Type B 6121，德國牛舍環(huán)境氣源性產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株20株和實驗一分離的57株產(chǎn)氣莢膜梭菌除

4、菌后，分別以60％和40％飽和度的硫酸銨溶液進(jìn)行兩次鹽析。所得沉淀溶解后先經(jīng)透析脫鹽處理，再經(jīng)SephadexG-200層析，并通過瓊脂擴散試驗檢測層析液的毒素免疫活性。將含有毒素活性的層析液合并濃縮后即得到較純的毒素。結(jié)果，經(jīng)SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定出德國牛舍環(huán)境氣源性產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株20株中A型16株、C型3株和D型1株；山東地區(qū)分離株57株均為A型。 第四部分：Multi-PCR和ELISA對產(chǎn)

5、氣莢膜梭菌毒素型別的檢測通過分別采用ELISA、多重PCR和SDS-PAGE方法對德國牛舍氣源性產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株和山東省分離株進(jìn)行型別研究，比較鑒定的結(jié)果，SDS-PAGE和ELISA方法檢測結(jié)果的符合率為95％，與多重PCR方法檢測結(jié)果的符合率為100％。結(jié)果表明SDS-PAGE方法與ELISA方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測結(jié)果有一定的差異性，與多重PCR方法的檢測結(jié)果一致。第五部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備及外毒素致病性的研究產(chǎn)氣莢

6、膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株和分離株接種營養(yǎng)肉湯進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后再接種Gordon湯，43℃厭氧振蕩培養(yǎng)6～7h。所得培養(yǎng)物經(jīng)低溫高速離心后，上清液即為產(chǎn)氣莢膜梭菌粗制外毒素。經(jīng)測定其對小白鼠的LD<,50>分別為0.00316和0.001。該外毒素用0.3％甲醛，分別滅活8h、16h、32h、64h、128h，加入鋁膠佐劑濃縮制得產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗。對該疫苗分別進(jìn)行了安全性檢驗、免疫效力試驗。結(jié)果表明用0.3％甲醛滅活32h可將產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒