房水微環(huán)境對樹突細(xì)胞成熟狀態(tài)的影響.pdf

1、目的：眼處于免疫赦免狀態(tài)和很多因素有關(guān)，其中包括解剖因素，如血眼屏障、缺少直接淋巴引流通路等，此外，房水中還存在大量起免疫抑制作用的因子對免疫細(xì)胞活性有廣泛的調(diào)節(jié)作用。樹突細(xì)胞(DCs)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(APC)，廣泛存在于虹膜、睫狀體和房水流出通道卻沒有得到應(yīng)有的關(guān)注。本實驗通過在體外模擬炎癥反應(yīng)環(huán)境，來觀察房水微環(huán)境對脂多糖(LPS)介導(dǎo)的DCs成熟的抑制作用。
　　 方法：取新鮮處死的豬的眼睛，保證球壁完整以防

2、房水被污染和滲漏，用含800U/ml慶大霉素的50％酒精浸泡15min以消毒。于角膜緣處用27G針頭刺入前房，使房水自動流入連接的硅化微量離心管，保存于-80℃;應(yīng)用ELISA法測定房水中PGE2含量；選用6-8周齡雄性C57BL/6小鼠，培養(yǎng)骨髓源DCs，培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，半量換液后，1μg/ml的LPS刺激48h，收集懸浮和半貼壁細(xì)胞即為成熟的DCs。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定DCs表面特異性分子標(biāo)記物CD11c以觀察細(xì)胞純度。為了研究房水對D

3、Cs成熟狀態(tài)的影響，將未成熟DCs分為三組：對照組（與1μg/mlLPS共培養(yǎng)48h），實驗1組(與1μg/mlLPS+25％AH共培養(yǎng)48h)，實驗2組（與1μg/mlLPS+50％AH共培養(yǎng)48h），并補(bǔ)足rmGM-CSF、培養(yǎng)液，48h后收集細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)做表型和內(nèi)吞功能的鑒定。尼龍毛柱法分離得到雄性6-8周齡BALB/c小鼠脾臟的T細(xì)胞，應(yīng)用于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)來觀察DCs刺激T細(xì)胞增殖的能力；根據(jù)文獻(xiàn)結(jié)果于房水中加入100

4、00倍于TGF-β2濃度的抗TGF-β2中和抗體(20μg/ml)，與DCs作用48h后檢測拮抗TGF-β2后房水對DCs成熟狀態(tài)的影響；第7天于DCs中加入AH6809(EP2受體拮抗劑)至終濃度為100μM，作用30min，以阻斷PGE2的作用的受體，半量換液加入房水，繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察DCs的成熟狀態(tài)。實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、DCs培養(yǎng)7天后，可見較多細(xì)胞呈半懸

5、浮生長，大量細(xì)胞集落形成，集落部分細(xì)胞表面出現(xiàn)長短不一毛刺樣突起，并可見少量單個懸浮的典型DCs，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定DCs表面特異性分子標(biāo)記物CD11c細(xì)胞純度達(dá)到70％。
　　 2、房水抑制DCs表型成熟：對照組呈現(xiàn)出表型成熟狀態(tài)，表現(xiàn)為高表達(dá)MHC-Ⅱ、CD80、CD86;實驗組可見依AH濃度呈劑量依賴性抑制DCs成熟，MHC-Ⅱ、CD80、CD86相應(yīng)的MFI明顯下降；各組的散點圖表明不同處理組并沒有影響DCs數(shù)量。

6、　　 3、房水抑制DCs功能成熟：流式細(xì)胞術(shù)檢測DCs吞噬FITC-dextran的能力發(fā)現(xiàn)，房水呈劑量依賴性抑制LPS介導(dǎo)內(nèi)吞功能；尼龍毛柱法分離得到BALB/c小鼠脾臟T細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD3+T細(xì)胞純度達(dá)到90％;混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對照組DCs經(jīng)LPS刺激后表現(xiàn)為強(qiáng)的刺激T細(xì)胞增殖能力，實驗2組較實驗1組刺激T細(xì)胞能力則減低，并在1∶10比例組可觀察到實驗2組的刺激能力是對照組1/3。
　　 4、阻斷細(xì)胞因子拮抗房

7、水的抑制作用：經(jīng)ELISA測得房水中PGE2的濃度為2603.919±771.1536pg/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于10-6mol/L，因此選用EP2受體特異性拮抗劑AH6809預(yù)處理DCs1h以阻斷PGE2細(xì)胞膜作用通路。培養(yǎng)液中加入房水、抗TGF-β2中和抗體、AH6809和DMSO并沒有影響CD11c的表達(dá)，也即各組DCs具有均一性。房水能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的DCsMHC-Ⅱ的高表達(dá)，而抗TGF-β2中和抗體預(yù)處理房水后則完全中和房水的抑

8、制作用。盡管封閉EP2受體對房水的抑制作用沒有影響，但是內(nèi)吞功能測定，同時拮抗EP2受體和中和TGF-β2可以協(xié)同提高DCs的內(nèi)吞功能。
　　 結(jié)論：
　　 1、房水呈劑量依賴性抑制LPS介導(dǎo)的DCs表型和功能的成熟，表現(xiàn)為低表達(dá)MHC-Ⅱ和共刺激分子CD80、CD86，高的內(nèi)吞功能以及弱的刺激T細(xì)胞增殖的能力。
　　 2、房水中TGF-β2在抑制LPS介導(dǎo)的DCs成熟過程中起主導(dǎo)作用。
　　 3、房水中