促甲狀腺激素通過甘油磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶3調(diào)節(jié)甘油三酯合成.pdf

1、目的:
　　1、確定促甲狀腺激素調(diào)節(jié)脂肪組織甘油三酯含量，利用亞臨床甲狀腺功能減退的小鼠模型及TSH刺激的成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞研究TSH對(duì)脂肪細(xì)胞甘油三酯合成的作用。
　　2、通過TSH受體敲除的小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的mRNA變化，篩選出TSH可能的作用靶點(diǎn)。
　　3、通過TSH刺激成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞，檢測(cè)GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的蛋白、mRNA水平，探討TSH引起脂質(zhì)合成增加的可

2、能機(jī)制。
　　4、通過TSH受體敲除的小鼠模型，檢測(cè)GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的蛋白、mRNA水平，進(jìn)一步探討TSH引起脂質(zhì)合成增加的可能機(jī)制。
　　5、利用PPARγ、AMPK特異性阻斷劑或TSHR、PPARγ、GPAT3特異性小干擾RNA（SmallⅠnterfering RNA，siRNA）或轉(zhuǎn)染持續(xù)激活或抑制性AMPK質(zhì)粒處理細(xì)胞，檢測(cè)GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的表達(dá)，

3、探討TSHR、AMPK、PPARγ、GPAT3在TSH所引起的脂質(zhì)沉積中所起的作用。
　　方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):1）3T3-L1細(xì)胞根據(jù)美國模式菌種收集中心(ATCC)細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)使用高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化。2）人脂肪原代細(xì)胞、小鼠脂肪原代細(xì)胞人或小鼠脂肪組織剪碎，使用Ⅰ型膠原酶在37℃孵箱中消化30-40 min，過篩去掉未消化的組織，PBS沖洗細(xì)胞，并接種在新的培養(yǎng)皿中，使用含新生牛血清的DMEM/F12

4、培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　2、動(dòng)物模型:通過小劑量他巴唑喂養(yǎng)建立亞臨床甲狀腺功能減退小鼠模型，并在Jackson實(shí)驗(yàn)室購買TSHR敲除小鼠模型。
　　3、采用RT-PCR檢測(cè)GPAT3、PPARγ mRNA的表達(dá)。
　　4、采用Western Blotting檢測(cè)GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK及beta-actin蛋白水平變化。
　　5、采用免疫熒光方法檢測(cè)GPAT3、PPARγ在脂肪組織及細(xì)胞中的表

5、達(dá)，H&E染色了解組織結(jié)構(gòu)。
　　6、GPAT3、PPARγ及TSHR基因沉默:以GPAT3、PPARγ及TSHR特異性siRNA轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞以沉默GPAT3、PPARγ及TSHR表達(dá)。
　　7、AMPK持續(xù)激活或抑制:以CA-AMPK或DN-AMPK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞以持續(xù)激活或抑制AMPK表達(dá)。
　　8、GPAT3、PPARγ活性檢測(cè):采用熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè)GPAT3、PPAR

6、γ的活性。
　　9、采用酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)小鼠體內(nèi)adiponectin的水平變化。
　　結(jié)果:
　　1、促甲狀腺激素調(diào)節(jié)脂肪組織甘油三酯含量:亞臨床甲狀腺功能減退的小鼠表現(xiàn)為體重增加，總脂肪重量增加，有較高的BMI水平及附睪脂肪指數(shù)。進(jìn)一步處死小鼠后分別觀察了兩組小鼠的附睪、腎周白色脂肪組織的外觀及脂肪細(xì)胞的體積大?。℉&E染色），發(fā)現(xiàn)亞臨床甲狀腺功能減退的小鼠附睪、腎周白色脂肪組織含量較對(duì)照組小鼠顯著增加，脂肪細(xì)胞體

7、積增大。通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，促甲狀腺激素刺激顯著增加成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量。與之一致的，3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯含量在TSH的刺激下呈時(shí)間、劑量依賴性的增加。
　　2、TSH調(diào)節(jié)甘油三酯合成是通過GPAT3:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TSHR敲除的小鼠體內(nèi)GPAT3 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著下降。體外研究發(fā)現(xiàn)TSH能刺激GPAT3的蛋白表達(dá)及其在胞漿的聚集并增加GPAT3的活性。利用GPAT3 siRNA干擾掉GPAT3

8、后，TSH介導(dǎo)的甘油三酯合成被阻斷。
　　3、PPARγ在促甲狀腺激素介導(dǎo)的脂質(zhì)生成中是必不可少的:體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，TSHR敲除的小鼠PPARγ mRNA水平較對(duì)照組小鼠水平下降。Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TSHR敲除的小鼠PPARγ蛋白較對(duì)照組小鼠表達(dá)水平下降。體外研究顯示，在成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞中，利用免疫熒光的方法檢測(cè)PPARγ的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TSH刺激的細(xì)胞PPARγ蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的聚集明顯。Wester

9、n blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TSH刺激的成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞、人原代脂肪細(xì)胞及小鼠原代脂肪細(xì)胞中PPARγ核蛋白表達(dá)顯著增加。實(shí)時(shí)定量PCR顯示促甲狀腺激素刺激的成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞PPARγmRNA表達(dá)顯著增加。利用PPARγ siRNA干擾掉PPARγ后，TSH介導(dǎo)的甘油三酯合成及激活GPAT3的作用被阻斷。
　　4、AMPK介導(dǎo)TSH引起的PPARγ/GPAT3上調(diào)及脂質(zhì)合成:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AICAR喂養(yǎng)的TS

10、HR受體敲除的小鼠脂肪組織PPARγ、GPAT3的蛋白、mRNA表達(dá)均下降。體外研究顯示，轉(zhuǎn)染CA-AMPK抑制TSH引起的PPARγ/GPAT3上調(diào)及脂質(zhì)合成;轉(zhuǎn)染DN-AMPK激活TSH引起的PPARγ/GPAT3上調(diào)及脂質(zhì)合成。
　　5、TSHR參與TSH介導(dǎo)的脂質(zhì)生成:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TSHR敲除的小鼠表現(xiàn)為體重下降，附睪脂肪重量降低，有較低的附睪脂肪指數(shù)。進(jìn)一步處死小鼠后分別觀察了兩組小鼠的附睪、腎周白色脂肪組織的外觀及脂

11、肪細(xì)胞的體積大小(H&E染色)，發(fā)現(xiàn)TSHR敲除的小鼠附睪、腎周白色脂肪組織含量較野生型小鼠顯著降低，脂肪細(xì)胞體積下降。Western顯示TSHR敲除的小鼠GPAT3表達(dá)下降。通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，利用TSHR siRNA干擾掉TSHR后，TSH介導(dǎo)的甘油三酯合成及激活A(yù)MPK/PPARγ/GPAT3的作用被阻斷。
　　結(jié)論:
　　在成熟脂肪細(xì)胞中，TSH通過結(jié)合到TSH受體，阻斷AMPK Thr172位點(diǎn)的磷酸化，激活PPAR