MRP8和IL-1β與內(nèi)側(cè)顳葉癲癇的關(guān)系和分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　癲癇是目前世界第三大慢性腦性疾病，亦是小兒神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一。內(nèi)側(cè)顳葉癲癇(mesial temporal lobe epilepsy, MTLE)是其重要的亞型，是目前公認(rèn)的難治性癲癇之一，以海馬硬化為其突出的臨床病理特征。目前對于藥物難治性MTLE的治療主要是手術(shù)切除硬化的病變海馬，進(jìn)而控制癲癇發(fā)作，減少驚厥給大腦造成的損害，但是一部分接受海馬切除的患者，仍然有驚厥的反復(fù)發(fā)作，這提示，海馬硬化并不是引起

2、患者抽搐最根本的原因，癲癇的慢性自發(fā)發(fā)作還有更為根本的原因未被人類所認(rèn)識。正因?yàn)槿狈TLE發(fā)病機(jī)制的了解，目前MTLE主要的治療方法還是在手術(shù)切除硬化海馬的基礎(chǔ)上，使用促細(xì)胞膜穩(wěn)定的抗癲癇藥物，通過減少神經(jīng)元異常放電，而控制驚厥發(fā)作，但針對癲癇病因及發(fā)病機(jī)制的治療甚少。
　　兒童時期的癲癇以及癲癇綜合征與成年期有很大不同。在不成熟大腦中，由于大腦及突觸的快速發(fā)育，使得癲癇發(fā)生的敏感性達(dá)到峰值。雖然癲癇可以在任何年齡發(fā)生，但最初

3、的致癇損傷多發(fā)生于生后不久以及幼年時期，因?yàn)榇藭r神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不成熟，易受異常代謝、創(chuàng)傷、基因突變等有害因素影響，為癲癇慢性形成埋下種子。而這些有害因素影響機(jī)體時，機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)所處的成熟階段，也是決定癲癇發(fā)作閾值和發(fā)作類型的關(guān)鍵因素。近二十年的研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)激活、過度的炎癥反應(yīng)在癲癇慢性自發(fā)發(fā)作過程中起著持續(xù)而重要的作用，而在發(fā)育中的大腦，與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的炎癥反應(yīng)能增加癲癇發(fā)作頻率以及大腦對癲癇的敏感程度，增加癲癇的易感性。因此，了解

4、炎癥與癲癇發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，對于MTLE發(fā)病機(jī)制研究有著重要意義。
　　髓樣受體蛋白8(Myoloid-Related Protein8，MRP8)是近年炎癥研究領(lǐng)域逐漸被關(guān)注的新星，它是S100家族的一員，在炎癥過程中表達(dá)于激活的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并被認(rèn)為是多種炎癥相關(guān)性疾病中的前炎癥標(biāo)志蛋白。促炎因子白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)在癲癇患者及癲癇模型鼠的海馬內(nèi)均有高表達(dá)，并被認(rèn)為在癲癇進(jìn)展過程中起重要作

5、用。 IL-1β可由反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte，AS)誘導(dǎo)產(chǎn)生，繼而誘發(fā)下游的炎癥瀑布反應(yīng)。而這種持續(xù)炎癥反應(yīng)的存在，對癲癇向慢性自發(fā)發(fā)作轉(zhuǎn)變，起著重要作用。然而，什么因素導(dǎo)致AS活化進(jìn)而分泌IL-1β引發(fā)炎癥反應(yīng)？MRP8是否與IL-1β分泌有關(guān)？IL-1β通過什么途徑促進(jìn)MTLE進(jìn)展呢？目前未見詳細(xì)報道。本研究立足于炎癥與MTLE發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性研究，嘗試從炎癥來源以及炎癥促M(fèi)TLE進(jìn)展的作用機(jī)制入手，尋找MTLE慢性自

6、發(fā)發(fā)作的可能原因，以期為今后通過干預(yù)發(fā)病機(jī)制減緩或阻斷難治性MTLE慢性進(jìn)程、改善MTLE預(yù)后提供新視角。
　　研究方法:
　　本研究分為三部分:
　　1.以25日齡Sprague-Dawley(SD)大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，用匹羅卡品腹腔注射誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)鼠癲癇發(fā)作，制作MTLE大鼠模型。致癇后連續(xù)觀察8周，有癲癇自發(fā)發(fā)作的模型鼠被納入實(shí)驗(yàn)，并對納入的模型進(jìn)行鑒定，鑒定內(nèi)容包括:模型鼠行為學(xué)改變、腦電圖(Electroenceph

7、alography，EEG)改變，尼氏染色觀察神經(jīng)元丟失情況，以及Timm染色觀察海馬神經(jīng)元苔蘚樣出芽等;無菌條件下取新生48h內(nèi)SD鼠大腦，分離大腦皮層和海馬分別用于星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AS)和神經(jīng)元的培養(yǎng)。利用胰酶消化法獲得單細(xì)胞懸液，經(jīng)重復(fù)傳代，獲得體外培養(yǎng)的高純度原代AS;利用差率貼壁和神經(jīng)元培養(yǎng)專用Neurobasal+Glutmax+B27無血清培基培養(yǎng)，獲得體外培養(yǎng)的高純度原代海馬神經(jīng)元。分別用膠質(zhì)纖維酸性蛋

8、白(GlialFibrillary Acidic Portein，GFAP)和微管結(jié)合蛋白2(MicrotubuleAssociated Protein2，MAP2)進(jìn)行AS及神經(jīng)元鑒定。
　　2.運(yùn)用免疫印跡(Western Blot，WB)、熒光定量RT-PCR(Realtime quantitativeRT-PCR， qPCR)、電泳遷移率變動分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay，E

9、MSA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、免疫組織化學(xué)（Immunological Histological Chemistry，IHC）、間接熒光免疫雙標(biāo)法等實(shí)驗(yàn)方法檢測MTLE患者及MTLE模型鼠海馬組織內(nèi)髓樣相關(guān)蛋白（Myoloid-Related Protein8，MRP8）、Toll樣受體-4(Toll-like receptor4，TLR4)、核因子-kap

10、pa B(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)以及IL-1β的表達(dá)變化。利用MRP8刺激體外培養(yǎng)的AS，運(yùn)用Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染發(fā)卡樣小干擾RNA（Hairpin siRNA，shRNA）使TLR4沉默、二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)預(yù)處理阻斷NF-κB，檢測TLR4、NF-κB以及IL-1β的表達(dá)變化及相互作用關(guān)系。
　　3.運(yùn)用WB、免疫共沉

11、淀(co-immunoprecipitation，co-IP)、FM4-64熒光標(biāo)記等方法檢測MTLE患者及MTLE模型鼠海馬組織內(nèi)磷脂酰肌醇3激酶-p85亞基(Phosphatidyl Inositol3-kinase-p85，PI3K-p85)、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase，Akt)、磷酸化的靶蛋白核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6kinas

12、e，p70S6k)以及與白介素-1受體（Interleukin-1 receptor，IL-1RI）結(jié)合的PI3k-p85的表達(dá)變化，并運(yùn)用IL-1β刺激體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元，運(yùn)用慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA使PI3K-p85沉默、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白((MammalianTarget Of Rapamycin，mTOR)抑制劑Rapamycin預(yù)處理阻斷mTOR、PP2抑制p85向IL-1RI募集等方式預(yù)處理神經(jīng)元，檢測PI3K-p85、與

13、IL-1RI結(jié)合的PI3k-p85、p-Akt、p-p70S6k以及MAP2在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)變化及相互作用關(guān)系;利用FM4-64染色觀察各組神經(jīng)元突觸胞吞情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.匹羅卡品腹腔注射可以誘導(dǎo)SD模型鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作及癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE），并經(jīng)過一段無驚厥發(fā)作的潛伏期后，模型鼠出現(xiàn)癲癇慢性自發(fā)發(fā)作。EEG呈現(xiàn)典型癲癇樣放電;尼氏染色顯示在急性期CA1區(qū)和慢性期CA1區(qū)、C

14、A3區(qū)、DG區(qū)有神經(jīng)元脫失以及變性、膠質(zhì)細(xì)胞增生（與對照組比較，p＜0.05）;Timm染色顯示慢性期模型鼠海馬組織CA3區(qū)及門齒區(qū)可見異常苔蘚纖維出芽，異常興奮環(huán)路形成（與對照組比較，p＜0.05）。體外培養(yǎng)的AS經(jīng)GFAP鑒定，純度在98％以上;體外培養(yǎng)的神經(jīng)元，經(jīng)MAP2鑒定，純度在95％以上。
　　2.發(fā)現(xiàn)MTLE患者海馬組織內(nèi)MRP8、TLR4、NF-κB以及IL-1β的表達(dá)增加（與對照組比較，p＜0.05）。MTLE大

15、鼠海馬內(nèi)MRP8、TLR4、NF-κB以及IL-1β在急性期和慢性期表達(dá)增加（與對照組比較，p＜0.05），而潛伏期表達(dá)僅輕微增加（與對照組比較，p＞0.05）。利用MRP8刺激體外培養(yǎng)的AS，細(xì)胞內(nèi)的TLR4、NF-κB以及IL-1β表達(dá)增加（與對照組比較，p＜0.05），并且NF-κB由胞漿向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，IL-1β在細(xì)胞上清液中含量增加（與對照組比較，p＜0.05）;抑制TLR4可以下調(diào)MRP8所致的NF-κB和IL-1β表達(dá)增加（

16、與MRP8組比較，p＜0.05）以及NF-κB向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移;抑制NF-κB只能下調(diào)MRP8所致的IL-1β表達(dá)增加（與MRP8組比較，p＜0.05）。
　　3.發(fā)現(xiàn)MTLE患者海馬組織內(nèi)PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6k以及與IL-1RI結(jié)合的PI3K-p85表達(dá)增加（與對照組比較，p＜0.05）。 MTLE模型鼠海馬內(nèi)上述蛋白在急性期、潛伏期和慢性期表達(dá)均增加（與對照組比較，p＜0.05）。利用IL-1β刺激體外培養(yǎng)

17、的海馬神經(jīng)元，細(xì)胞內(nèi)PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6k、MAP2以及與IL-1RI結(jié)合的PI3K-p85表達(dá)均增加（與對照組比較，p＜0.05），并且神經(jīng)元突觸的胞吞作用明顯加?。ㄅc對照組比較，p＜0.05）;抑制PI3K-p85可以下調(diào)IL-1β所致的p-Akt、p-p70S6k和MAP2表達(dá)增加（與IL-1β組比較，p＜0.05），神經(jīng)元突觸的胞吞作用減弱（與IL-1β組比較，p＜0.05）;抑制mTOR也能下調(diào)IL-1

18、β所致的PI3K-p85、p-Akt、p-P70S6K和MAP2表達(dá)增加（與IL-1β組比較，p＜0.05），神經(jīng)元突觸的胞吞作用減弱（與IL-1β組比較，p＜0.05）;抑制p85亞基與IL-1RI的結(jié)合也可以下調(diào)IL-1β所致的p-Akt、p-P70S6K和MAP2表達(dá)增加（與IL-1β組比較，p＜0.05）。
　　研究結(jié)論:
　　1.成功誘導(dǎo)出具有慢性自發(fā)發(fā)作的幼鼠MTLE模型，并在體外培養(yǎng)出了高純度的原代AS和原代海