大鼠肝微粒體CYP2C19的活性測(cè)定及聯(lián)合用藥對(duì)其影響的相關(guān)研究.pdf

1、目的：藥物反應(yīng)個(gè)體差異是臨床用藥中的常見(jiàn)現(xiàn)象，認(rèn)識(shí)和闡明藥物反應(yīng)個(gè)體差異及其產(chǎn)生機(jī)制是提高藥物治療效果、安全合理用藥的重要課題。藥物代謝差異是造成臨床藥物反應(yīng)差異最主要的原因。近年來(lái)的研究已證實(shí)，藥物代謝學(xué)的研究成果無(wú)論對(duì)臨床用藥還是新藥研發(fā)都具有重要意義。肝臟是藥物代謝的主要器官，主要存在于肝細(xì)胞微粒體中的細(xì)胞色素P450（CYP450）是體內(nèi)最重要也是大的藥物代謝酶系，主要參與藥物在體內(nèi)的氧化代謝，同時(shí)也與致癌物、類(lèi)固醇激素和脂肪酸

2、的氧化代謝有關(guān)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)200多種CYP450酶。在CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，有15個(gè)亞家族，其中CYP2A～2E存在于哺乳動(dòng)中，CYP2C是其中最大的亞家族，該亞家族中CYP2C9、CYP2C19與藥物代謝關(guān)系密切?，F(xiàn)已證實(shí)CYP2C19與幾十種藥物的體內(nèi)代謝密切相關(guān)，主要參與藥物在體內(nèi)的羥化反應(yīng)。由于CYP2C19活性存在顯著的個(gè)體差異和種族差異，表現(xiàn)為遺傳多態(tài)性，可使多種藥物在體內(nèi)的代謝產(chǎn)生個(gè)體差異，導(dǎo)致血藥濃度

3、的個(gè)體差。如果多種藥物經(jīng)CYP2C19代謝，同時(shí)服用這些藥物，易產(chǎn)生相互作用，從而影響藥物在體內(nèi)的代謝，最終影響療效或產(chǎn)生不良反應(yīng)。故研究CYP2C19酶的活性及其影響因素對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥非常重要。本研究的目的是建立大鼠肝微粒體CYP2C19酶的體外培養(yǎng)體系及活性測(cè)定方法，研究大鼠肝微粒體CYP2C19酶的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)及聯(lián)合用藥對(duì)其活性的影響，從而預(yù)測(cè)藥物經(jīng)CYP2C19酶代謝的過(guò)程，為進(jìn)一步研究CYP2C19酶提供方法和參考依據(jù)，同時(shí)

4、也可預(yù)測(cè)臨床合并用藥時(shí)藥物的相互作用，防止不良藥物相互作用的發(fā)生，為臨床醫(yī)師合理用藥提供理論參考，也為理解細(xì)胞色素P450酶的機(jī)制和底物譜提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究主要是以?shī)W美拉唑?yàn)镃YP2C19酶的探針?biāo)幬?，研究用反相高效液相法（RP-HPLC）測(cè)定大鼠肝微粒體CYP2C19酶的活性；進(jìn)一步優(yōu)化大鼠肝微粒體體外培養(yǎng)體系，測(cè)定使用不同藥物后，培養(yǎng)體系中奧美拉唑（OMZ）及其主要代謝物5-羥基奧美拉唑（5-OHOMZ）的含量變化；反映藥物對(duì)CY

5、P2C19酶活性的影響。總結(jié)和分析經(jīng)CYP2C19酶代謝的藥物聯(lián)合用藥時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題，避免出現(xiàn)酶的誘導(dǎo)或抑制，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。 方法：取雄性大鼠，體重190±10g，斷頭處死后，用鈣鹽沉淀法制備大鼠肝微粒體勻漿，置-70℃低溫冰箱中保存。于凍存2、4、6個(gè)月分別取凍融的微粒體，進(jìn)行蛋白質(zhì)含量及CYP450酶總量測(cè)定。用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析法對(duì)大鼠肝微粒體CYP2C19酶的體外培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，建立大鼠肝微粒體CYP4

6、50酶系的體外培養(yǎng)體系；并通過(guò)選擇不同的條件，對(duì)其酶動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行研究；建立CYP2C19酶活性的測(cè)定方法，采用RP-HPLC測(cè)定培養(yǎng)體系中奧美拉唑及其代謝產(chǎn)物5-羥基奧美拉唑的濃度，色譜條件：Phenomenex C8柱（4．6mm×150mm，5μm）；島津Shim-pack C8預(yù)柱（4．6 mm×10 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-0．02mol/L，磷酸（26：74，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)為302 nm；流速：1．0 mL/min

7、；柱溫：30℃；進(jìn)樣量20 μL；以非那西丁作為內(nèi)標(biāo)物；以5-羥基奧美拉唑（5-OHOMZ）與奧美拉唑（OMZ）的比值（5-OHOMZ/OMZ）表示CYP2C19酶的活性。利用建立的培養(yǎng)體系及CYP2C19酶活性的測(cè)定方法，在培養(yǎng)體系中加入臨床常用藥物（化合物），測(cè)定CYP2C19酶的活性變化，考察臨床上聯(lián)合用藥對(duì)CYP2C19酶活性的影響。 結(jié)果：采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定大鼠肝微粒體CYP2C19酶培養(yǎng)體系中OMZ和5-O

8、HOMZ的濃度，建立了CYP2C19酶活性的測(cè)定方法，該方法具有快捷有效的樣品前處理，樣品分析時(shí)間少，良好的分離度和可靠性的特點(diǎn)。結(jié)果顯示奧美拉唑在1～15 μmol/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，5-OHOMZ在0．1～5 μg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析法對(duì)體外培養(yǎng)條件優(yōu)化選擇得出的最佳培養(yǎng)條件是：代謝系統(tǒng)總體積為1 mL，其中50 mmol/L的NADPH 0．02 mL，大鼠肝微粒體蛋白混合液0．05 mL，350 μm

9、ol/L的奧美拉唑0．02 mL，100 mg/L的內(nèi)標(biāo)非那西丁0．02 mL，加PH為7．4的磷酸鹽緩沖液定容至1 mL，在37℃培養(yǎng)20 min。CYP2C19酶的米氏常數(shù)Km=69．16 μmol/L和Vmax=11．34μmol·min-1·mL-1（培養(yǎng)液），最適反應(yīng)溫度為37℃，培養(yǎng)緩沖液最適pH為7．4，該酶對(duì)pH的變化較敏感，對(duì)熱極不穩(wěn)定。在臨床常用藥物中，氯霉素、西米替丁、氧化苦參堿、紫杉醇、丹參酮ⅡA、環(huán)磷酰胺與異環(huán)

10、磷酰胺等藥物對(duì)CYP2C19酶活性具有較顯著的抑制作用；而苯妥英鈉、丹參素鈉等藥物對(duì)CYP2C19酶具有較顯著的酶促作用；硝苯地平、美托洛爾，維拉帕米對(duì)CYP2C19酶活性影響不明顯。 結(jié)論：本研究建立的CYP2C19酶體外培養(yǎng)體系及活性測(cè)定的反相高效液相色譜法操作簡(jiǎn)便、靈敏、快速，可同時(shí)測(cè)定OMZ和5-OHOMZ的濃度，適合用于體內(nèi)外研究藥物代謝時(shí)CYP2C19酶活性的測(cè)定。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)體系中的CYP2C19酶動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)分析可以