2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、CYP3A是細(xì)胞色素P450(CYP)家族中的主要成員,同屬CYP3A家族重要成員且同源性較高的CYP3A4、CYP3A5在肝臟表達(dá)非常豐富,參與許多外源性(藥物、環(huán)境毒物/致癌物)和內(nèi)源性物質(zhì)(固醇類激素)的代謝。由于CYP3A4/5代謝活性個體差異很大,許多研究針對CYP3A4/5活性個體差異的原因進(jìn)行了探討。早期研究主要將活性的個體差異歸因于基因多態(tài)性和環(huán)境因素,隨著研究進(jìn)一步深入,研究者認(rèn)識到表觀遺傳甚至蛋白間的相互作用也是引起

2、CYP3A4/5活性個體差異的原因。CYP3A4/5的立體結(jié)構(gòu)靈活多變,可參與許多物質(zhì)的代謝。由于底物的多樣性,因此CYP3A4/5對一種底物的代謝活性并不一定能夠反映其對另一種底物的代謝活性。鑒于此,美國FDA推薦探究CYP3A4/5活性時需使用兩種探針?biāo)幬铮ㄟ溥_(dá)唑侖和睪酮)。但至今未見采用大樣本的正常人肝微粒體研究CYP3A4/5代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的酶動力學(xué)間的相關(guān)性,并且大多數(shù)代謝活性的研究是在人體內(nèi)和重組酶系統(tǒng)中展開的,前者不能

3、單一反映出CYP3A4/5的代謝過程,后者與人體內(nèi)環(huán)境有一定的差異。因此,人肝微粒體是與人體最接近的體外代謝研究平臺。
  本研究擬以105例正常人肝微粒體為研究對象,以咪達(dá)唑侖和睪酮為探針底物,分別探討并比較CYP3A4/5對兩種探針底物代謝活性的個體差異,分別考察并比較基因多態(tài)性、人口學(xué)因素、環(huán)境因素、蛋白相互作用對CYP3A4/5代謝兩種探針底物活性的影響,同時分析了CYP3A4/5對兩種探針底物代謝活性的相關(guān)性。通過本研究

4、,以期闡明CYP3A4/5對不同底物代謝活性存在較大個體差異的原因,為臨床合理應(yīng)用經(jīng)CYP3A4/5代謝的藥物提供有價值的理論依據(jù)。
  方法:
  1肝臟標(biāo)本的收集
  收集肝功能正常的肝血管瘤患者肝標(biāo)本105例,標(biāo)本均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院。其中男性37例,女性68例,年齡為20-75歲,用藥史顯示,手術(shù)近期沒有服用能夠顯著影響CYP酶活性的藥物。
  2人肝微粒體的制備
  采用差速

5、離心法制備人肝微粒體,并且用Bradford法測定人肝微粒體的蛋白濃度。
  3人肝微粒體代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的酶動力學(xué)
  首先確定最佳孵育條件(合適的微粒體蛋白濃度和最佳孵育時間)。其次進(jìn)行肝微粒體體外溫孵實驗,選取咪達(dá)唑侖和睪酮為CYP3A4\5底物,配制人肝微粒體孵育體系(探針底物、磷酸鹽緩沖液及水),預(yù)孵育后,加入NADPH啟動反應(yīng),蛋白沉淀終止反應(yīng)后離心取上清,HPLC法檢測代謝產(chǎn)物濃度。
  4 CYP3A

6、4/5和CYP2D6的基因分型
  采用基因組柱式提取試劑盒從肝組織中提取全基因組DNA,設(shè)計CYP3A4/5及CYP2D6特異性引物,用特定引物擴(kuò)增出含有突變位點(diǎn)的片段,經(jīng)測序確定其基因型。
  5統(tǒng)計方法
  使用GraphPad Prism5.0求得每例標(biāo)本的酶動力學(xué)參數(shù),使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。
  結(jié)果:
  1人肝微粒體代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的酶動力學(xué)
  分別以咪

7、達(dá)唑侖和睪酮為底物。人肝微粒體中CYP3A4/5代謝咪達(dá)唑侖的酶動力學(xué)參數(shù)Km、Vmax和CLint的中位數(shù)分別為:1.85μM、789.60pmol·min-1·mg-1 protein、464.60μL·min-1·mg-1protein,范圍分別為0.44~10.20μM、69.40~5035.00 pmol·min-1mg-1 protein及8.27~1673.53μL·min-1·mg-1 protein,Km、Vmax和C

8、Lint差異倍數(shù)分別為23.18、72.55和202.36倍。人肝微粒體中CYP3A4/5代謝睪酮的酶動力學(xué)參數(shù) Km、Vmax和CLint的中位數(shù)分別為:41.46μM、4785.50 pmol·min-1·mg-1protein、107.09μL·min-1·mg-1protein,范圍分別為22.19~152.50μM、265.60~10679.00pmol·min-1mg-1protein及1.74~278.09μL·min-1

9、·mg-1protein,Km、Vmax和CLint差異倍數(shù)分別為6.87、40.21和159.82倍。
  2咪達(dá)唑侖和睪酮酶動力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性
  采用Spearman檢驗對咪達(dá)唑侖和睪酮的酶動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析,CYP3A4/5對咪達(dá)唑侖和睪酮代謝的Vmax呈現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性(r=0.643),CLint呈現(xiàn)出弱相關(guān)性(r=0.245),Km不存在相關(guān)性。
  3基因多態(tài)性對CYP3A4/5代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的影

10、響
  3.1 CYP3A4/5的基因多態(tài)性對酶動力學(xué)參數(shù)的影響
  結(jié)果顯示,CYP3A420230 G>A位點(diǎn)突變會增加咪達(dá)唑侖的Km和Vmax,對睪酮代謝沒有影響。CYP3A56986A>G位點(diǎn)突變會降低咪達(dá)唑侖的Km和Vmax,也會降低睪酮的Vmax,而CYP3A420070T>C的基因多態(tài)性對兩種底物的酶動力學(xué)參數(shù)均無影響。
  3.2 CYP2D6的基因多態(tài)性對酶動力學(xué)參數(shù)的影響
  結(jié)果顯示,CYP

11、2D61661G>C基因多態(tài)性可影響咪達(dá)唑侖的Km,與GC基因型相比,CC基因型代謝咪達(dá)唑侖的Km降低,但對CLint和Vmax無影響。CYP2D61661G>C基因多態(tài)性對睪酮的酶動力學(xué)參數(shù)無影響。CYP2D6100C>T基因多態(tài)性可影響睪酮的Vmax,與CC基因型相比,CT基因型的Vmax升高,但對Km和CLint無影響。CYP2D6100C>T基因多態(tài)性對咪達(dá)唑侖的酶動力學(xué)參數(shù)均無影響。
  4吸煙、飲酒、性別和年齡對CYP

12、3A4/5代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的影響
  統(tǒng)計分析的結(jié)果表明,吸煙、飲酒、性別和年齡對人肝微粒體CYP3A4/5代謝咪達(dá)唑侖和睪酮的酶動力學(xué)參數(shù)均無顯著的影響。
  結(jié)論:
  1.人肝微粒體CYP3A4/5對咪達(dá)唑侖和睪酮的代謝活性存在顯著的個體差異。
  2.人肝微粒體CYP3A4/5對咪達(dá)唑侖和睪酮代謝的Vmax呈現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性(r=0.643),CLint呈現(xiàn)出弱相關(guān)性(r=0.245),Km不存在相關(guān)性。<

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