蘇云金芽孢桿菌介導(dǎo)的小菜蛾精氨酸激酶基因的RNA干擾.pdf

1、RNA干擾（RNA interference，簡(jiǎn)稱RNAi）技術(shù)已被開(kāi)發(fā)利用于害蟲(chóng)控制，但具體的應(yīng)用技術(shù)還有待進(jìn)一步研究。本論文嘗試在蘇云金芽孢桿菌（Bt）中表達(dá)小菜蛾精氨酸激酶基因（PxAK）的dsRNA，通過(guò)Bt介導(dǎo)來(lái)沉默小菜蛾上的PxAK，達(dá)到殺蟲(chóng)的目的，以期為RNAi技術(shù)在小菜蛾防治中的應(yīng)用提供新的途徑。具體研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：
　　PxAK氨基酸序列的分析結(jié)果表明，PxAK與家蠶、棉鈴蟲(chóng)、斜紋夜蛾等14種鱗翅目昆蟲(chóng)的精氨

2、酸激酶（AK）一致性達(dá)91％-95%，與其他目昆蟲(chóng)的同源性也都在81%以上。推斷了基因保守區(qū)域并以其中的325 bp片段（AKi）作為RNAi的靶標(biāo)。克隆Bt的啟動(dòng)子序列pro3a，在其后連接上AKi，然后連接到質(zhì)粒pHT304上，最后把啟動(dòng)子pro3a反向連接到AKi的另一端，得到質(zhì)粒pHT304+pro3a(+)+AKi+pro3a(-)，命名為pHTAKR。利用重疊延伸PCR技術(shù)突變pHTAKR中來(lái)自質(zhì)粒pHT304的Sph I酶

3、切位點(diǎn)，從而獲得只有單個(gè)Sph I酶切位點(diǎn)的載體pHTAKR2。
　　利用電穿孔技術(shù)把載體pHTAKR2分別轉(zhuǎn)入Bt BMB171和Bt8010，獲得工程菌BMB171-AKi和8010-AKi。經(jīng)檢測(cè)，工程菌8010-AKi中存在晶體蛋白，但晶體數(shù)量比Bt8010少，且形狀由菱形為主轉(zhuǎn)變成菱形、方形、橢圓形等多種形狀并存；工程菌8010-AKi的生長(zhǎng)速率在對(duì)數(shù)期比菌株8010慢，形成的芽孢數(shù)也少；在經(jīng)選擇壓處理的工程菌8010-

4、AKi中，30代內(nèi)外源質(zhì)粒pHTAKR2的穩(wěn)定性都在90%以上。
　　用Bt菌液浸泡處理的葉片喂飼小菜蛾，發(fā)現(xiàn)工程菌8010-AKi處理的小菜蛾幼蟲(chóng)在兩天后開(kāi)始出現(xiàn)死亡，第六天死亡率達(dá)60%，死亡個(gè)體主要出現(xiàn)體節(jié)皺縮，胸部扁縮等由于AK被抑制后的形態(tài)，但比8010的死亡率低；工程菌BMB171-AKi處理的幼蟲(chóng)第六天死亡率達(dá)53.3%，比BMB171的死亡率高，其死亡個(gè)體也出現(xiàn)了體節(jié)皺縮等由于 AK被抑制后的形態(tài)，而無(wú)因Bt毒蛋白