紫莖澤蘭基因EaC4H的克隆及化感相關(guān)基因功能分析.pdf

1、紫莖澤蘭作為世界性入侵雜草在中國被認定為外來入侵物種之首，自從上世紀40年代傳入中國之后已經(jīng)對中國的生態(tài)和經(jīng)濟造成極大影響。目前國內(nèi)外對于紫莖澤蘭的研究主要集中在其入侵模式、生態(tài)學(xué)特性、防除方法和利用等方面。紫莖澤蘭化感物質(zhì)在生物入侵過程中發(fā)揮了重要的作用，其作用機制可能是通過影響植物光合作用、各種代謝以及根系生長和對礦質(zhì)元素吸收等許多方面來實現(xiàn)入侵。然而目前，對于與次生代謝相關(guān)的化感物質(zhì)的代謝調(diào)控機理方面的研究還很少，本文就是圍繞這一

2、點開展研究工作。本文擬針對與紫莖澤蘭化感相關(guān)的代謝途徑中相關(guān)基因進行克隆和功能分析，為紫莖澤蘭的綜合治理提供理論依據(jù)，以期能夠找到調(diào)控化感物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶的編碼基因，發(fā)掘一些能夠為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所利用的新基因。本論文的研究結(jié)果如下:
　　通過RACE技術(shù)，首次克隆了紫莖澤蘭肉桂酸四羥化酶基因的全長(GenBankID:KF751239)，將其命名為EaC4H。EaC4H全長1882bp，最大開放閱讀框架1518bp，推斷其編碼505個氨

3、基酸，預(yù)測該蛋白分子量為57.8，等電點PI為9.2。該蛋白具有P450結(jié)構(gòu)域。根據(jù)EaC4H基因的3’非翻譯區(qū)序列設(shè)計引物，進行Real-TimePCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn):經(jīng)過不同濃度羥基澤蘭酮處理，EaC4H基因的表達水平出現(xiàn)不同程度上調(diào)。Southern blot分析表明該基因在紫莖澤蘭中至少有5個拷貝;洋蔥細胞的瞬時表達顯示，EaC4H蛋白具有細胞核定位功能。
　　為探討紫莖澤蘭CHS(EaCHS)基因和C4H(EaC4H)基

4、因功能，試驗分別構(gòu)建EaCHS和EaC4H基因的植物過表達載體和干涉載體，并利用葉盤浸染法將構(gòu)建的植物表達載體轉(zhuǎn)入到煙草NC89中，分別獲得上述兩基因的煙草干涉和過表達轉(zhuǎn)化植株。
　　實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測EaCHS基因煙草轉(zhuǎn)化植株化感代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的表達量并測定了煙草中化感物質(zhì)總酚和類黃酮的含量。試驗結(jié)果表明:與野生型煙草相比，EaCHS過表達煙草的化感代謝途徑關(guān)鍵酶基因CHS，CHI，C4H, PAL

5、，4CL，F(xiàn)3'H，DXR，HMGR，TS，相對表達量均極顯著性上調(diào)(P＜0.01)，總酚和類黃酮的含量也相應(yīng)顯著性增加(P＜0.01); EaCHS干涉煙草化感代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的相對表達量均下調(diào)(P＜0.05)，同時總酚和類黃酮的含量也相應(yīng)降低(P＜0.05)。
　　實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測EaC4H過表達轉(zhuǎn)基因煙草T1代葉片中C4H基因表達量比野生型煙草上調(diào)近21倍，但其他被檢測相關(guān)酶CHS，CHI, C4H

6、，PAL，4CL，F(xiàn)3H, DXR，HMGR和TS表達量卻呈不同程度下調(diào)趨勢，EaC4H的干涉轉(zhuǎn)基因煙草T1代葉片中上述各被檢測酶基因表達量與C4H均呈下調(diào)趨勢。HPLC檢測轉(zhuǎn)基因煙草葉片中C4H的活性與C4H基因表達量呈相應(yīng)變化趨勢，但次生代謝物總酚和類黃酮含量均低于野生型煙草。
　　鹽脅迫和干旱脅迫條件下，EaCHS過表達轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)率高于野生型和干涉型，葉綠素（Chlorophyll），丙二醛(MDA)、超氧陰離子(O

7、2-)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的等生理指標的檢測表明EaCHS過表達轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽和耐干旱性能也得到明顯提高，但EaCHS干涉轉(zhuǎn)基因煙草的種子萌發(fā)對鹽和干旱脅迫敏感高于野生型，幼苗的耐鹽和耐干旱性能明顯降低。EaCHS基因在煙草中表達量提高之后，提高植物對逆境的適應(yīng)性，由此推斷該基因可能為植物在逆境（干旱，鹽）中的生存提供幫助。
　　鹽脅迫和干旱脅迫條件下，EaC4H過表達和干涉型轉(zhuǎn)