抗雙向情感障礙藥長期作用通過下調(diào)TRPC1表達抑制星形膠質(zhì)細胞Ca2+依賴的谷氨酸釋放.pdf

1、前言：
　　雙向情感障礙(Bipolar disorder，BPD)是一種嚴重的精神系統(tǒng)疾病，全球發(fā)病率約為2-5％。以疾病的躁狂期和抑郁期反復出現(xiàn)為主要特征，患者不僅表現(xiàn)為情緒紊亂，如情感高漲或低落，也伴有相應認知、行為以及生理節(jié)律的改變，其發(fā)病機制尚不清楚，是一種受遺傳和環(huán)境影響的疾病。
　　谷氨酸是神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞之間信息傳遞的重要神經(jīng)遞質(zhì)，是增強神經(jīng)元突觸可塑性和細胞活力的主要因素，目前大量研究證明谷氨酸系統(tǒng)在情感障

2、礙的調(diào)解中起重要作用，已成為BPD發(fā)病及藥物治療研究的新熱點。谷氨酸不僅在腦的發(fā)育、神經(jīng)元的分化遷移、軸突形成中起重要作用，還參與調(diào)節(jié)腦的高級功能，如突觸可塑性、學習、記憶、認知等，對BPD死亡患者腦組織研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸表達異常增高，應用MRI檢測結(jié)果也顯示BPD患者躁狂期腦內(nèi)谷氨酸系統(tǒng)活性增高，此外一些研究資料顯示應用作用于谷氨酸系統(tǒng)的藥物如利魯唑、氯胺酮、拉莫三嗪等具有抗BPD作用，因此探明谷氨酸系統(tǒng)在BPD發(fā)病中的作用對疾病的治療具

3、有重要意義。
　　星形膠質(zhì)細胞是谷氨酸的攝取、代謝和循環(huán)的主要場所，最新的研究認為BPD患者腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞功能障礙是引起谷氨酸異常的主要原因。神經(jīng)元缺乏丙酮酸羧化酶和谷氨酰胺合成酶，自身不能合成谷氨酸和谷氨酰胺，星形膠質(zhì)細胞的主要功能是合成谷氨酰胺并轉(zhuǎn)運到神經(jīng)元。突觸間隙低濃度的谷氨酸對興奮性的傳遞十分重要，星形膠質(zhì)細胞另一個重要功能就是清除細胞外過多的谷氨酸，將谷氨酸從胞外逆濃度梯度轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，終止突觸部位谷氨酸的興奮性傳遞，

4、此外星形膠質(zhì)細胞本身也可釋放谷氨酸，與神經(jīng)元之間進行信息傳遞，谷氨酸釋放水平發(fā)生改變將會嚴重影響其與神經(jīng)元之間的這種雙向、密切的信息交流，并導致各種疾病狀態(tài)的產(chǎn)生。在BPD患者腦內(nèi)已發(fā)現(xiàn)谷氨酸表達異常伴隨著星形膠質(zhì)細胞的丟失，雖然腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞的異常改變在BPD發(fā)病過程中所起的具體作用仍不清楚，但研究資料顯示其功能障及引起的谷氨酸代謝改變可能是導致BPD的主要原因，目前已成為BPD病理生理機制研究的一個新熱點。
　　星形膠質(zhì)細胞

5、可通過多種方式釋放谷氨酸，但病理狀態(tài)下Ca2+依賴的方式是其釋放的主要機制，細胞內(nèi)Ca2+來源主要依賴于細胞外Ca2+通道內(nèi)流以及胞內(nèi)Ca2+儲池釋放這兩條途徑，研究表明細胞內(nèi)Ca2+儲池釋放是引起谷氨酸釋放的主要因素。在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上存在兩種功能性的Ca2+儲池，IP3敏感性Ca2+儲池和Ryanodine敏感性Ca2+儲池，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲池釋放后可通過激活細胞膜上瞬時受體電位通道(TRPC)，引起胞外Ca2+內(nèi)流補充胞內(nèi)Ca

6、2+損失，已證實TRPC是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)濃度的主要通道。
　　目前使用的抗BPD藥物在臨床上均不能取得較好的療效，特別是在患者抑郁期的治療，有相當比例的患者即使全療程服用不同的藥物也不能取得療效，而開發(fā)更加有效的治療藥物所面臨的主要困難就是對疾病發(fā)生的病理基礎尚不清楚。可溶性鋰鹽、丙戊酸鈉和卡馬西平是目前治療雙相精神障礙的常用藥，三種藥物化學結(jié)構(gòu)均無相似之處，臨床上在BPD的躁狂期能引起較好的療效，但是這些藥物發(fā)揮療效的確

7、切藥理機制目前尚未闡明，研究藥物潛在的共同作用機制是探尋新的藥物治療策略的有效途徑。有研究顯示大鼠給予鋰鹽和丙戊酸鈉慢性處理兩周能明顯降低腦內(nèi)谷氨酸含量，卡馬西平慢性作用也能降低高K+誘導的大鼠海馬神經(jīng)末梢谷氨酸的釋放，我們實驗室之前的研究證明三種藥物長期作用可引起星形膠質(zhì)細胞堿化，抑制細胞對肌醇的攝取，也能上調(diào)細胞cPLA2表達，下調(diào)細胞谷氨酸受體GluK2亞型的表達，提示三種藥物可能對星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2+及Ca2+依賴的谷氨酸釋放

8、具有調(diào)節(jié)作用，本課題采用原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞方法，觀察鋰鹽、丙戊酸鈉和卡馬西平長期作用對細胞外高K+刺激誘發(fā)的谷氨酸釋放的抑制作用并探討其作用機制，為BPD的藥物治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　取新生小鼠大腦皮質(zhì)進行星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)，加入雙丁酰環(huán)腺苷酸(dBcAMP)作用1周促進細胞分化成熟。分別加入用碳酸鋰(Li2CO3)、丙戊酸鈉(VPA)、卡馬西平(CBZ)長期作用細胞2周，進行如下實驗:①用高效液相色譜法檢測

9、細胞外高K+刺激引起的谷氨酸釋放量。②細胞用熒光探針染料Fura-2負載，奧林巴斯活細胞熒光顯微鏡下檢測三種抗抑郁藥慢性作用對細胞內(nèi)Ca2+儲存釋放功能的影響。③RT-PCR法檢檢測三種抗抑郁藥長期處理對細胞TRPC1mRNA表達的影響。
　　實驗結(jié)果采用使用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組資料用one-wayANOVA方法進行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、三種抗BPD藥物長期

10、作用2周對星形膠質(zhì)細胞谷氨酸釋放的抑制作用
　　培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細胞在應用PBS緩沖液刺激時只釋放基礎量的谷氨酸，當換成45 mM高K+緩沖液刺激后，能促發(fā)2-5倍谷氨酸釋放的增加，當再次應用PBS緩沖液刺激后，谷氨酸釋放量又回復基礎釋放量。成熟的星形膠質(zhì)細胞應用Li2CO3(0.25、0.5、1 mM)、CBZ(25μM、50μM)和VPA(100μM、1mM)作用2周對谷氨酸基礎釋放量沒有影響，但不同濃度的三種藥物均可明顯抑

11、制高K+緩沖液引起的谷氨酸釋放量的增加，表現(xiàn)為與對照組細胞相比，第6、7、8、9、10 min谷氨酸釋放量明顯減少，具有統(tǒng)計學差異。
　　2、細胞外高K+刺激可通過外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放引起星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加
　　培養(yǎng)于蓋玻片上成熟的星形膠質(zhì)細胞用Fura-2處理后進行細胞內(nèi)Ca2+測定，用340 nm與380 nm的熒光比值(F340/F380)表示細胞內(nèi)Ca2+濃度。結(jié)果顯示細胞應用45mMK+刺激

12、能持久引起細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，分別應用L-型電壓依賴鈣通道抑制劑Nifedipine和RyR抑制劑Ryanodine后均可抑制45mMK引起的細胞內(nèi)Ca2+的增加，細胞膜Na+-Ca2+交換抑制劑KB-R7943對45mMK+刺激引起細胞內(nèi)Ca2+的增加無影響。
　　3、三種抗BPD藥物長期作用可抑制45 mM K引起的細胞內(nèi)Ca2+濃度升高的水平和持續(xù)時間
　　細胞應用45mMK刺激能持久引起細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加

13、，應用Li2CO3、CBZ、VPA作用2周后的星形膠質(zhì)細胞給予45 mM K+刺激后，細胞內(nèi)Ca2+增加幅度降低，且很快恢復正常，表現(xiàn)為高K+刺激后第3、5、7、9、11 min的熒光比值較對照組細胞各時間點明顯降低，具有統(tǒng)計學差異。
　　4、三種抗雙相BPD藥物長期作用可抑制Adenophostin A(AdA)引起的細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加
　　AdA是IP3R的激動劑，IP3R是IP3依賴的Ca2+通道，激動IP3R能

14、引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存Ca2+的釋放。應用Li2CO3、CBZ和VPA作用2周后能明顯抑制AdA刺激引起的細胞內(nèi)Ca2+的增加，取激動劑刺激后3個循環(huán)的熒光比值結(jié)果進行統(tǒng)計分析，與對照組細胞相比，三種藥物長期作用組細胞內(nèi)Ca2+增加幅度明顯降低。
　　5、三種抗雙相BPD藥物長期作用可抑制4-Chloro-M-Cresol(4-CMC)引起的細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加
　　4-CMC是RyR的激動劑，RyR是Ca2+依賴的Ca2+

15、通道，激動RyR能引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存Ca2+的釋放。應用Li2CO3、CBZ、VPA作用2周后能明顯抑制4-CMC刺激引起的細胞內(nèi)Ca2+的增加，取激動劑刺激后5個循環(huán)的熒光比值結(jié)果進行統(tǒng)計分析，與對照組細胞相比，三種藥物長期作用組細胞內(nèi)Ca2+增加水平明顯降低。
　　6、三種抗BPD藥物長期作用可抑制星形膠質(zhì)細胞Ca2+再充功能
　　Thapsigargin是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+-ATP酶的抑制劑，將細胞加入Thapsig

16、argin作用10 min，耗竭星形膠質(zhì)細胞內(nèi)儲存的Ca2+，再重新加入CaCl2后，Li2CO3、CBZ、VPA作用2周能明顯抑制星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2+再充功能。取加入CaCl2后的2 min內(nèi)的熒光比值結(jié)果進行統(tǒng)計分析，與對照組細胞相比，三種藥物長期作用組細胞內(nèi)Ca2+增加水平明顯降低。
　　7、三種抗雙相BPD藥物長期作用可抑制TRPC1 mRNA表達
　　RT-PCR結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細胞應用Li2CO3、CBZ、VP

17、A作用2周后TRPC1mRNA表達較對照組細胞明顯降低，具有統(tǒng)計學意義。
　　討論：
　　谷氨酸是星形膠質(zhì)細胞釋放的與神經(jīng)元之間進行雙向信息傳遞的重要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，是增強神經(jīng)元突觸可塑性和細胞活力的主要因素，本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Li+、CBZ、VPA長期作用能抑制高K+引起的星形膠質(zhì)細胞谷氨酸釋放。目前雖然谷氨酸在BPD發(fā)病中的機制還不清楚，但一些研究資料預示谷氨酸信號通路在BPD患者躁狂期增強而在抑郁期減弱，如應用MRI檢

18、測結(jié)果發(fā)現(xiàn)BPD患者躁狂期腦內(nèi)谷氨酸系統(tǒng)活性增高，對BPD死亡患者腦組織進行特異性染色發(fā)現(xiàn)谷氨酸活性增高伴隨著大腦海馬苔狀纖維過渡生長，而臨床治療中BPD患者抑郁期采用利魯唑和氯胺酮可產(chǎn)生較好的療效，研究表明利魯唑不僅能增強Na+依賴的谷氨酸攝取，也能引起星形膠質(zhì)細胞Na+-Ca2+逆向轉(zhuǎn)運，促進Ca2+內(nèi)流進而引起谷氨酸遞質(zhì)釋放，在BPD的抑郁期增加患者腦內(nèi)谷氨酰胺/谷氨酸的比率，減輕抑郁癥狀，氯胺酮在半麻醉劑量使用，具有快速抗抑郁作

19、用，研究認為這與增強神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞谷氨酸-谷氨酰胺代謝循環(huán)相關。Li+、CBZ、VPA在臨床使用中均在BPD的躁狂期具有較好療效，而在抑郁期治療效果不如利魯唑、拉莫三嗪等其他藥物，本研究結(jié)果與三種藥物在BPD臨床治療中所觀察到的現(xiàn)象一致，此外臨床上也發(fā)現(xiàn)長期服用Li+制劑維持治療時可加重BPD患者抑郁期的癥狀，這可能也與本實驗結(jié)果所顯示的Li+長期作用對星形膠質(zhì)細胞谷氨酸釋放的抑制有關，因此這些研究提示谷氨酸鹽的平衡可能在BPD發(fā)

20、病中起到重要作用，尋找調(diào)節(jié)谷氨酸系統(tǒng)的特效藥物可能在BPD治療中具有重要意義。
　　星形膠質(zhì)細胞在病理狀態(tài)下通過Ca2+依賴的方式釋放谷氨酸，研究報道BPD患者躁狂期細胞內(nèi)Ca2+水平明顯高于正常人，而在BPD抑郁期或無癥狀期患者細胞內(nèi)Ca2+無明顯變化，這與發(fā)現(xiàn)的BPD患者躁狂期腦內(nèi)谷氨酸系統(tǒng)活性增高相一致。本研究發(fā)現(xiàn)三種抗BPD藥物長期作用能明顯抑制細胞外高K+引起的細胞內(nèi)Ca2+增加。高K+可通過激活電壓依賴性Ca2+通道和

21、促進細胞內(nèi)Ca2+儲池釋放兩種方式增加細胞內(nèi)Ca2+，但研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲存Ca2+釋放是引起谷氨酸釋放主要原因，如Hua等用機械刺激激活星形膠質(zhì)細胞膜上電壓依賴性Ca2+通道，進而引起Ca2+依賴的谷氨酸釋放，但在應用IP3R和RyR拮抗劑后，機械刺激引起的谷氨酸釋放明顯被抑制，本實驗中在進一步應用IP3R和RyR激動劑后細胞內(nèi)Ca2+增加也被抑制，這提示細胞內(nèi)Ca2+儲池再充功能可能被抑制，細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放后TRPC是Ca2+

22、再充的主要通道，在星形膠質(zhì)細胞胞漿膜上主要表達TRPC1，本實驗中應用Ca2+-ATP酶抑制劑Thapsigargin耗竭細胞內(nèi)儲存Ca2+后，在細胞外重新加入2mM CaCl2，也僅能部分引起細胞內(nèi)Ca2+的增加，同時本實驗也發(fā)現(xiàn)三種抗BPD藥物均能明顯下調(diào)細胞TRPC1mRNA的表達，這些結(jié)果進一步證實抑制Ca2+的再充功能是三種抗BPD抑制細胞內(nèi)Ca2+的機制之一。此外我們實驗室之前的研究顯示三種藥物長期給藥可通過使星形膠質(zhì)細胞堿

23、化，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞對肌醇的攝取，并上調(diào)細胞cPLA2表達。抑制星形膠質(zhì)細胞對肌醇的攝取可減少IP3產(chǎn)生以及引起的細胞內(nèi)儲存Ca2+的釋放，cPLA2表達與花生四烯酸的代謝有關，研究表明花生四烯酸以復雜的方式干擾細胞內(nèi)游離Ca2+濃度。我們之前的研究也顯示三種藥物長期給藥也能下調(diào)細胞谷氨酸受體GluK2受亞型的表達。應用GluK2的拮抗劑NS102或?qū)胹iRNA將GluK2基因沉默后均能明顯抑制谷氨酸引起的細胞內(nèi)Ca2+的增加，進一

24、步研究發(fā)現(xiàn)GluK2受體與磷脂酶C相關聯(lián)的，可通過調(diào)節(jié)IP3表達影響細胞內(nèi)儲存Ca2+的釋放。
　　綜上所述，本研究所使用的三種抗雙向情感障礙藥物可通過抑制肌醇攝取、上調(diào)細胞cPLA2表達、下調(diào)GluK2及TRPC1表達多個環(huán)節(jié)抑制星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2+的增加，進而抑制細胞Ca2+依賴的谷氨酸釋放，這可能是藥物治療BPD的潛在作用機制之一。本研究結(jié)果從離體水平上為抑制星形膠質(zhì)細胞谷氨酸釋放在抗BPD治療中的作用提供了一定的理論依據(jù)

25、，但星形膠質(zhì)細胞釋放谷氨酸在突觸前神經(jīng)元、突觸后神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞之間進行興奮性傳遞是一種復雜的調(diào)節(jié)作用，應用MRI技術檢測也發(fā)現(xiàn)谷氨酸-谷氨酰胺在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞代謝循環(huán)中是一種動態(tài)調(diào)節(jié)過程，因此BPD患者谷氨酸調(diào)節(jié)功能機制的失常遠比觀察到的遞質(zhì)改變復雜，因此探明谷氨酸系統(tǒng)在BPD發(fā)病中的作用從而開發(fā)出更有效的治療藥物還需大量的深入研究。
　　結(jié)論：
　　1、Li2CO3、VPA和CBZ三種抗雙相精神障礙藥物長期作用均能抑制