谷氨酸誘導小鼠大腦皮層星形膠質細胞ATP釋放路徑的研究.pdf

1、前言
　　星形膠質細胞是中樞神經系統的重要組成部分，在神經元的營養(yǎng)與保護、誘導神經干細胞再生、免疫調節(jié)、參與信號傳導、參與疼痛調節(jié)機制等中起到重要作用。星形膠質細胞與神經元之間存在著密切的機構和功能聯系，通過神經元興奮釋放的遞質可作用于星形膠質細胞，星形膠質細胞受到刺激后也釋放遞質作用于神經元，調節(jié)神經元的興奮性和突觸傳遞。其中主要的神經遞質是谷氨酸與ATP。
　　谷氨酸是一種重要的興奮性神經遞質。星形膠質細胞是谷氨酸攝取、

2、代謝、和循環(huán)的主要場所，通過對谷氨酸的釋放與重吸收來維持胞外的相對低濃度，以利于突觸間興奮性的傳遞。但是在腦缺血、缺氧、腦外傷、腦水腫等病理條件下，會造成細胞外高濃度的谷氨酸，產生谷氨酸的興奮性毒性，加劇細胞和組織的損傷，導致不良結果。
　　ATP是細胞內的供能物質，也是重要的神經遞質。星形膠質細胞的ATP釋放涉及到一系列的神經元的活動，并且也對自身產生一定的影響。在水腫、機械刺激、谷氨酸和NO刺激等條件下都會發(fā)生星形膠質細胞的A

3、TP釋放。研究表明星形膠質細胞在低滲或缺血缺氧等條件下，會出現大量的ATP的釋放和胞外高濃度聚集，并參與繼發(fā)性神經細胞凋亡或壞死。
　　ATP和谷氨酸在神經系統的功能活動中，既有各自的作用途徑和環(huán)節(jié)，又有緊密的相互關系，相互影響。既往有關星形膠質細胞ATP或谷氨酸在各種生理或病理情況下對細胞功能活動的影響研究比較多，但二者之間的相互作用關系卻很少有報道。所以本研究中，分別觀察不同濃度谷氨酸刺激條件下細胞外液中ATP的濃度變化，明確

4、其釋放途徑，并進一步觀察細胞外液中ATP變化對細胞狀態(tài)的影響。尋找有效的方法減少該條件下細胞內ATP的外流，減少谷氨酸和ATP共同作用所致的星形膠質細胞和神經細胞的損傷。
　　方法
　　采用原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層星形膠質細胞，①分成三組:A對照組;B谷氨酸處理組(再分為谷氨酸濃度不同的亞組，分別加入谷氨酸0.1mM，0.3mM，1.0mM);C谷氨酸處理+ATP釋放途徑抑制劑組（再分為抑制不同ATP釋放途徑的幾個亞組，分別加

5、入VSOR氯離子通道抑制劑DCPIB10μM;大陰離子通道抑制劑氯化釓50μM;半通道抑制劑carbenoxolone100μM（同時亦作用于pannexins）;囊泡介導途徑抑制劑BFA5μM和P2X7受體抑制劑考馬斯亮蘭G1μM)。于加入谷氨酸前，加入谷氨酸后3min，5min，15min，30min，1hr，2hr，4hr，6hr收集細胞外液檢測ATP濃度。②分為A對照組;B谷氨酸處理組（谷氨酸終濃度為0.3mM）C谷氨酸處理+A

6、TP釋放途徑抑制劑組氯化釓50μM，在特定的時間點0h、2h、6h、12h、24h吸取細胞外液進行LDH釋放的測定，來觀察細胞膜的完整性。③分為A對照組;B谷氨酸處理組（谷氨酸終濃度為0.3mM）;C谷氨酸處理+ATP釋放途徑抑制劑組氯化釓50μM組，在特定的時間點0h、2h、6h、12h、24h用Hoechst-PI雙染色法檢測形態(tài)學及細胞膜完整性。
　　實驗數據以均數±標準差表示，SPSS17.0統計學軟件分析數據。多組資料采

7、用單因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05表示差異有統計學意義。
　　結果
　　1、谷氨酸引起的星形膠質細胞ATP釋放
　　培養(yǎng)成熟的星形膠質細胞細胞外液中基礎量的ATP（5.941±0.740nM），當加入0.1mM，0.3mM，1.0mM谷氨酸后，3min時引起ATP釋放的增加，大約在5min時達到頂點，細胞外液ATP濃度能達到基礎量的1.5～2倍，與谷氨酸的濃度成正相關。之后ATP的濃度回落到基礎值，但是在連續(xù)

8、處理1hr時又會出現第二個小峰值。與對照組細胞相比，1.0mM谷氨酸組在3min、5min、15min、60min能促進ATP釋放的增加，具有統計學差異;0.3mM組在3min、5min、15min具有統計學差異;0.1mM組在5min時有統計學差異。
　　2、谷氨酸誘導的ATP釋放途徑研究。
　　VSOR氯離子通道抑制劑DCPIB10μM、半通道抑制劑carbenoxolone100μM、囊泡介導途徑抑制劑BFA5μM和P

9、2X7受體抑制劑考馬斯亮蘭G（1μM）均不能阻滯谷氨酸引起的ATP釋放，與谷氨酸處理組相比，沒有統計學差異。
　　大陰離子通道抑制劑氯化釓50μM能夠抑制谷氨酸引起的ATP釋放，與谷氨酸處理組相比，在3min、5min、1hr這三個時間點能抑制谷氨酸引起ATP的釋放，具有統計學差異。
　　3、谷氨酸引起的星形膠質細胞形態(tài)學及細胞膜完整性的檢測。
　?、貺DH釋放:與對照組相比，6hr之內，谷氨酸處理組與抑制劑組差異沒有

10、顯著性;但是12hr時谷氨酸處理組與抑制劑組LDH釋放增加;24hr時與對照組相比差異具有統計學意義，抑制劑組的凋亡率低于單純谷氨酸處理組。
　?、贖oechst-PI雙染:在6hr之內，各組細胞狀態(tài)沒有明顯改變，12hr之后谷氨酸組陽性細胞所占比例增加，24hr時損傷加重，加入抑制劑組損傷較谷氨酸組損傷輕。
　　1、大陰離子通道是谷氨酸誘導的星形膠質細胞釋放ATP的重要途徑。
　　2、通過抑制谷氨酸誘導的ATP的釋放