GATA-6在氟西汀抗MCT誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈高壓中的作用機(jī)制研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓((pulmonary artery hypertension，PAH)是許多心肺血管疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的病理生理環(huán)節(jié)。在這個(gè)病理生理過(guò)程中，肺血管重構(gòu)是重要的病理基礎(chǔ)。肺血管重構(gòu)的特征為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)的異常堆積使肺血管壁增厚、管腔狹窄、順應(yīng)性降低，其中血管平滑肌細(xì)胞的大量增殖是肺血管重構(gòu)的重要病理變化，伴隨有許多細(xì)胞因子的參與，但其增殖機(jī)制目前尚未闡明。
　　 GATA結(jié)合蛋白6(GAT

2、A-6)是唯一表達(dá)于血管平滑肌的GATA家族轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于正常靜止的、分化表型的平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells，SMCs)。在損傷、有絲分裂素刺激下，可以參與細(xì)胞周期相關(guān)基因和平滑肌特異性基因的調(diào)節(jié)。在增殖的平滑肌細(xì)胞中，GATA-6mRNA水平是下調(diào)的。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，腺病毒介導(dǎo)的GATA-6基因轉(zhuǎn)染球囊損傷后的頸動(dòng)脈，能阻止血管損傷形成，這說(shuō)明GATA-6與血管平滑肌細(xì)胞表型調(diào)節(jié)有關(guān)。而過(guò)度表達(dá)GATA-6可

3、以誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)的停滯，這種抑制作用能通過(guò)增加細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶抑制劑P21的表達(dá)及穩(wěn)定其轉(zhuǎn)錄后性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。GATA-6基因腺病毒轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞的微點(diǎn)陣基因芯片分析，GATA-6轉(zhuǎn)錄因子也能激活內(nèi)皮素-1和血管緊張素la受體基因的轉(zhuǎn)錄，促使血管平滑肌從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，這可能是血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖對(duì)血流動(dòng)力學(xué)和體液刺激的適應(yīng)性應(yīng)答。以上研究說(shuō)明GATA-6轉(zhuǎn)錄因子是血管平滑肌細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子。
　　 P21是細(xì)胞周

4、期蛋白依賴(lài)激酶抑制劑之一，具有抑制周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK)活性的作用，可以抑制增殖核抗原(PCNA)復(fù)制DNA的活性。在低氧、MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠中，發(fā)現(xiàn)P21表達(dá)下調(diào)，P53通過(guò)目標(biāo)產(chǎn)物P21發(fā)揮抑制血管重構(gòu)。增殖的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)P21表達(dá)下調(diào)。
　　 我們前期工作發(fā)現(xiàn)了選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(serotonin transporter inhibitors，SSRIs)氟西汀抑制MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈

5、高壓大鼠右心室肥厚和肺血管重塑，大鼠肺組織和右心室中GATA結(jié)合蛋白4（GATA-4）表達(dá)增多，氟西汀(fluoxetine)能夠劑量依賴(lài)的降低GATA-4的蛋白表達(dá)。我們認(rèn)為GATA-4參與氟西汀抑制MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓的右心室肥厚和肺血管重塑。GATA-6和GATA-4同屬于GATA家族，都能識(shí)別GATA序列元件。但GATA-6是否參與氟西汀抑制MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓的右心室肥厚和肺血管重塑，目前尚無(wú)報(bào)道。
　　 本研究采

6、用MCT誘導(dǎo)大鼠慢性肺動(dòng)脈高壓模型，通過(guò)給予模型動(dòng)物不同劑量氟西汀，觀察大鼠肺動(dòng)脈，肺組織和心臟的GATA-6基因及蛋白的表達(dá)變化，以此研究GATA-6在氟西汀抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓的可能機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　　 一、建立MCT誘導(dǎo)的慢性PAH大鼠模型
　　 體重200g左石的雄性Wistar大鼠32只，隨機(jī)分4組：Control組(Control)、MCT組(MCT)、MCT+氟西汀低劑量

7、組(MCT-F2)和MCT+氟西汀高劑量組(MCT-F10)。MCT-F2組和MCT-F10組大鼠每天分別給予氟西汀2mg/kg和10mg/kg灌胃，各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3周。給藥21天后，分別檢測(cè)肺動(dòng)脈壓力，右心肥厚指數(shù)：病理染色的方法檢測(cè)肺中小動(dòng)脈平滑肌增殖指數(shù)；用RT-PCR方法檢測(cè)肺動(dòng)脈，肺和心臟GATA-6和P21mRNA變化；免疫組化檢測(cè)GATA-6在肺組織的表達(dá)及部位。用統(tǒng)計(jì)分析的方法，比較不同組別各指標(biāo)差異，探討GATA-6

8、在氟西汀抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓的可能機(jī)制。
　　 二、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)以mean±SD表示，采用單因素方差分析。P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、氟西汀對(duì)MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠的體重及血流動(dòng)力學(xué)的影響
　　 與對(duì)照組相比，MCT組大鼠的體重明顯降低，由275.6±38.7g降至229.9±32.2g(

9、P＜0.01)，而氟西汀治療組與MCT相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組相比，MCT組大鼠平均肺動(dòng)脈壓顯著升高由16.6±3.0mmHg到30.5±4.9mmHg(P＜0.05);MCT+F10組明顯降低MCT引起的肺動(dòng)脈壓升高，平均肺動(dòng)脈壓降低到22.1±4.4(P＜0.05)，MCT+F2平均肺動(dòng)脈壓比MCT組低，但沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 二、氟西汀降低右心指數(shù)
　　 與對(duì)照組相比，MCT組大鼠右心指數(shù)顯著升高由26.6

10、±2.7％升高到54.4±9.3％(P＜0.05)，MCT+F10組降低了MCT引起的右心指數(shù)，從MCT組的54.4±9.3％降低到40.5±5.8％(P＜0.05)。
　　 三、氟西汀抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增殖
　　 與對(duì)照組相比，MCT組大鼠肺小動(dòng)和脈厚度由14.7±4.1um增加到29.8±7.0um(P＜0.01);MCT+F10組明顯降低MCT引起的血管壁增厚，由29.8±7.0um降低到22.1±3.2um(P

11、＜0.01)。
　　 四、肺動(dòng)脈GATA-6 mRNA、P21 mRNA的表達(dá)
　　 與對(duì)照組相比，MCT組大鼠肺動(dòng)脈GATA-6 mRNA和P21 mRNA表達(dá)明顯降低，分別由1.57±0.53降到0.69±0.16(P＜0.05)，1.70±0.37降到0.74±0.25;MCT+F2組增加MCT引起的GATA-6 mRNA、P21 mRNA表達(dá)降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，MCT+F10組顯著增加MCT引起的GATA-6 m

12、RNA、P21 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。
　　 五、肺組織GATA-6 mRNA、P21 mRNA的表達(dá)
　　 與對(duì)照組相比，MCT組大鼠肺組織GATA-6 mRNA表達(dá)明顯下降，由1.95±0.65降到0.56±0.18(P＜0.05); MCT+F2和MCT+F10組均能增加MCT引起的GATA-6 mRNA的下降，分別由0.56±0.18上升到0.96±0.25、0.99±0.20，但只有MCT+F1

13、0組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，MCT組大鼠肺組織P21 mRNA表達(dá)明顯下降，由1.44±0.12降到0.29±0.11(P＜0.01);MCT+F2和MCT+F10組均能增加MCT引起的P21 mRNA的下降，分別由0.29±0.11上升到0.75±0.09、0.89±0.36(P＜0.05)。
　　 六、右心及左心GATA-6 mRNA的表達(dá)
　　 與對(duì)照組相比，MCT組大鼠右心GATA-6 mRN

14、A表達(dá)明顯下降，由1.47±0.39降到0.38±0.11(P＜0.01);MCT+F2和MCT+F10組均能增加MCT引起的GATA-6mRNA的下降，分別由0.38±0.11上升到1.02±0.17(P＜0.01)、1.28±0.38(P＜0.01)。左心各組GATA-6 mRNA表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 七、氟西汀對(duì)MCT誘導(dǎo)的大鼠肺組織GATA-6和P21蛋白表達(dá)的影響
　　 免疫組織化學(xué)研究結(jié)果表明，GATA

15、-6和P21陽(yáng)性細(xì)胞著色定位免疫組織化學(xué)研究結(jié)果表明，GATA-6和P21陽(yáng)性細(xì)胞著色定位于細(xì)胞漿，染色深度不等，為棕黃色至深棕褐色。與對(duì)照組相比，MCT組大鼠肺組織GATA-6和P21陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，GATA-6陽(yáng)性細(xì)胞由22.86±13.77降至3.57±2.88(P＜0.01)，P21由28.63±13.77降至2.5±1.19(P＜0.01);MCT+F2和MCT+F10組GATA-6和P21陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，GATA-6干預(yù)