不同發(fā)育階段視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞的特性及其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化.pdf

1、目的：
　　 E13.5是小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育的高峰期，本研究通過(guò)比較小鼠E13.5和E17.5視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞(retinal precursor cells，RPCs)的差異基因表達(dá)、體外分化特點(diǎn)，為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal ganglion cells，RGCs)的替代治療尋找合適的種子細(xì)胞。進(jìn)一步用E13.5 RPCs和E17.5 RPCs誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal

2、stem cells，BMSCs)向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞分化，為BMSCs用于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的替代治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.取E13.5和E17.5昆明小鼠的RPCs，用含bFGF和EGF的無(wú)血清生長(zhǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；誘導(dǎo)分化時(shí)，將RPCs神經(jīng)球種于包被多聚賴(lài)氨酸(Poly-D-lysine，PDL)的六孔板中，貼壁培養(yǎng)。
　　 2.取新鮮取材、懸浮培養(yǎng)4d、貼壁培養(yǎng)4d、貼壁培養(yǎng)8d的E13.5和E

3、17.5 RPCs，用Realtime qRT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。RPCs貼壁分化8d后，用免疫熒光檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　 3.分別取野生型C57BL/6小鼠和C57BL/6-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用含10％ FBS的DF12培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。
　　 4.用Transwell分層共培養(yǎng)體系，將BMSCs與E13.5或E17.5 RPCs進(jìn)行分層共培養(yǎng)，分別在共培養(yǎng)3d，7d，14d和2

4、1d后取出BMSCs，檢測(cè)視網(wǎng)膜發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 5.將BMSCs-EGFP與E13.5 RPCs進(jìn)行混合接觸共培養(yǎng)，6d后用免疫熒光檢測(cè)Pax6和Brn3b等在BMSCs-EGFP的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.新鮮E13.5 RPCs高表達(dá)Math5，Brn3b，Islet1，Nfl等視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相關(guān)基因，比E17.5 RPCs分別高3.0倍、5.2倍、4.2倍和3.3倍；而E17.5 RPC

5、s高表達(dá)Nrl，Thy1和GFAP等基因，比E13.5 RPCs分別高23.6倍、83.3倍和4.0倍。
　　 2.新鮮E13.5 RPCs懸浮培養(yǎng)4d后，大多數(shù)基因與E17.5 RPCs的表達(dá)差異縮小。
　　 3.懸浮培養(yǎng)4d后，E13.5 RPCs表達(dá)Math5，Brn3b，Islet1稍有升高，而在E17.5RPCs則顯著下降；相反Nrl，GFAP在E17.5 RPCs則顯著升高。提示懸浮培養(yǎng)選擇性擴(kuò)增了不同的細(xì)胞

6、群。
　　 4.貼壁分化8d后，E17.5 RPCs高表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP，而E13.5 RPCs主要表現(xiàn)為Nestin和Nrl表達(dá)升高。
　　 5.普通傳代培養(yǎng)的BMSCs表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物，如Nestin，Tau，NSE等，但不表達(dá)Nfl，也不表達(dá)視網(wǎng)膜發(fā)育相關(guān)基因，如Pax6，Brn3b，Math5等。
　　 6.E13.5 RPCs與BMSCs分層共培養(yǎng)3d后可誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)Pa

7、x6，Islet1，Nfl，Brn3b，Math5等RGCs發(fā)育相關(guān)基因，但誘導(dǎo)效果不持久，免疫熒光難以檢測(cè)到Pax6和Brn3b的表達(dá)，這可能與E13.5 RPCs在體外共培養(yǎng)時(shí)基因表達(dá)發(fā)生了改變有關(guān)。而E17.5 RPCs難以有效誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)RGCs發(fā)育相關(guān)基因。
　　 7.E13.5 RPCs與BMSCs-EGFP混合接觸共培養(yǎng)能誘導(dǎo)BMSCs-EGFP表達(dá)Pax6和Brn3b，并能用免疫熒光檢測(cè)到。
　　

8、結(jié)論：
　　 1.E13.5 RPCs含有較多RGCs及RGCs前體細(xì)胞，可能更適合RGCs的細(xì)胞替代治療；而E17.5 RPCs含有較多視桿前體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞。
　　 2.體外貼壁分化時(shí)，E13.5 RPCs傾向于向視網(wǎng)膜神經(jīng)元方向分化，而E17.5 RPCs傾向于向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。
　　 3.E13.5 RPCs能有效誘導(dǎo)BMSCs向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞分化，細(xì)胞因子和細(xì)胞間的相互接觸在誘導(dǎo)分化中起重