宮頸癌Hela細(xì)胞中miR-21與PDCD4相互作用的研究.pdf

1、目的：應(yīng)用生物信息學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù)，在宮頸癌Hela細(xì)胞中預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-21的相關(guān)靶基因，探討miR-21與靶基因的相互作用及其與宮頸癌發(fā)病的關(guān)系，為進(jìn)一步研究宮頸癌發(fā)生的分子機(jī)制和宮頸癌基因治療方法提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：⑴應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析miR-21的染色體定位、保守性分析等，利用網(wǎng)絡(luò)共享軟件MicroCosm Targets、TargetScan和PicTar，分析其可能作用的靶基因。⑵用脂質(zhì)

2、體轉(zhuǎn)染的方法，將美國Ambion公司合成的pre-miR-21、pre-miRnegative control和anti-miR-21、anti-miR negative control瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測(cè)miR-21相對(duì)表達(dá)量。⑶蛋白免疫印跡方法(Western-blot)：提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、PDCD4抗體孵育，曝片顯影，利用軟件對(duì)PDCD4蛋白的相對(duì)含量進(jìn)行分析。⑷熒光素

3、酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：將PDCD4分子的3'UTR序列中miR-21結(jié)合位點(diǎn)上下游的部分片段導(dǎo)入pMIR-REPORT-luciferace熒光素酶報(bào)告基因載體，構(gòu)建重組載體(pMIR-Luc-PDCD4)，并進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。以重組載體(pMIR-Luc-PDCD4)、標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照載體(pMIR-REPORT-β-gal)與pre-miR-21或anti-miR-21共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)，72小時(shí)后分別檢測(cè)Hela細(xì)胞的熒光素酶(Luc

4、)和β半乳糖苷酶的活性，計(jì)箅二者的比值(Luc/β-gal)。同時(shí)設(shè)立三個(gè)對(duì)照組(no miRNA空白對(duì)照組、pre-miR-negative對(duì)照組和anti-miR-negative對(duì)照組)，比較各組Luc/β-gal比值，驗(yàn)證miR-21作用靶點(diǎn)的真實(shí)性。
　　 結(jié)果：①利用在線軟件PicTar、MicroCosm Targets和TargetScan預(yù)測(cè)miR-21的作用靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCD4可能是miR-21作用的靶

5、基因。②Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pre-miR-21后，細(xì)胞中PDCD4蛋白的表達(dá)水平下調(diào)(P＜0.01)；轉(zhuǎn)染anti-miR-21后，細(xì)胞中PDCD4蛋白的表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)。③利用pMIR-REPORT熒光素酶報(bào)告基因載體，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建重組載體pMIR-Luc-PDCD4-3'UTR。pMIR-REPORT熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三個(gè)對(duì)照組(no miRNA空白對(duì)照組、pre-miR-neg

6、ative對(duì)照組和anti-miR-negative對(duì)照組)，Luc/β-gal比值接近。實(shí)驗(yàn)組，pre-miR-21共轉(zhuǎn)染組，熒光素酶活性下降約43％(P＜0.001)；anti-miR-21共轉(zhuǎn)染組，熒光素酶活性升高約37％(P＜0.001)，表明PDCD4是miR-21的真實(shí)作用靶點(diǎn)。
　　 結(jié)論：⑴在宮頸癌Hela細(xì)胞中，miR-21調(diào)控抑癌基因PDCD4蛋白的表達(dá)，PDCD4是miR-21的重要靶基因。⑵miR-21在