組成型表達(dá)幾丁質(zhì)酶Bt519-1工程菌株的構(gòu)建及應(yīng)用評價.pdf

1、如今，對Bt(Bacillus thuringiensis)野生型菌株的改造成為研究熱點(diǎn)，國內(nèi)外有報道構(gòu)建Bt工程菌株的實(shí)例，大多數(shù)都是利用芽胞期依賴型cry基因的強(qiáng)啟動子與結(jié)構(gòu)基因一起構(gòu)建融合基因，而利用幾丁質(zhì)酶chi基因自身的強(qiáng)啟動子的范例甚少。尋找一個能夠在營養(yǎng)期組成型且高效的chi基因啟動子，不僅可以打破芽胞期表達(dá)的局限，而且可以提高幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量，可謂一舉兩得。利用這樣的啟動子來提高Bt制劑的生防效果，達(dá)到殺蟲毒力較高、抑真

2、菌效果好、重組工程菌株遺傳性狀穩(wěn)定等目的，成為本研究的創(chuàng)新所在。
　　本研究一方面從幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)調(diào)控分子機(jī)制的探索入手，以其營養(yǎng)期啟動子操縱區(qū)域的dre位點(diǎn)為研究材料，通過堿基定點(diǎn)置換技術(shù)研究dre位點(diǎn)對幾丁質(zhì)酶表達(dá)類型的影響，確定dre位點(diǎn)在基因表達(dá)調(diào)控過程中的重要功能。另一方面，從組成型啟動子中選取啟動活性最高效的作為構(gòu)建工程菌株的啟動子，進(jìn)而利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建組成型表達(dá)幾丁質(zhì)酶Bt工程菌株，并對工程菌生防應(yīng)用潛能進(jìn)行

3、進(jìn)一步的評價，為有針對性地進(jìn)行芽胞桿菌的定向分子育種提供實(shí)例。
　　本研究Bti75幾丁質(zhì)酶基因chiB啟動子操縱區(qū)含有一個16bp(-112～-97位)的回文序列，稱為dre位點(diǎn)(DasR蛋白應(yīng)答元件)。對該區(qū)域所有堿基位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)置換后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照啟動子（-504～-89位）相比，在此基礎(chǔ)上-99/-98位TC→GA、-102位A→C、-103位G→T、-109位C→A、-111/-110位GA→AG堿基的置換都使啟動子在

4、不誘導(dǎo)條件下啟動的β-半乳糖苷酶的活性有所上升，其中-109位點(diǎn)置換后酶活上升得最高，是對照啟動子啟動酶活力的11倍，是全長啟動子的3.3倍;而-108、-101、-105、-104四個位點(diǎn)的堿基置換后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子在誘導(dǎo)和不誘導(dǎo)條件下酶活很低，推測該四個堿基位點(diǎn)與阻遏物的結(jié)合緊密程度有關(guān);其他堿基位點(diǎn)-97、-100、-106、-107、-112位雖然沒有改變酶的表達(dá)類型，仍然是誘導(dǎo)型，但是酶的表達(dá)量發(fā)生了改變，有所上升或下降。上述結(jié)果

5、證明chiB啟動子操縱區(qū)dre位點(diǎn)在幾丁質(zhì)酶表達(dá)類型的調(diào)控中起重要作用，同時也達(dá)到了獲得組成型高效啟動子的目的。
　　本研究成功構(gòu)建一株幾丁質(zhì)酶活性較野生菌提高3～3.5倍的工程菌株Bt519-1(pDM)，實(shí)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶ChiMY75的異源表達(dá)。對工程菌的特性研究表明重組質(zhì)粒在工程菌株的發(fā)酵過程中能比較穩(wěn)定地傳代，四天后質(zhì)粒保存率仍能達(dá)到90％以上。兩株菌發(fā)酵上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，發(fā)現(xiàn)了一條大約67kD的特異蛋白條帶，

6、酶譜分析實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，該特異表達(dá)蛋白條帶是幾丁質(zhì)酶。
　　對于工程菌株的應(yīng)用評價首先在平板上進(jìn)行抑菌譜的初篩，比較菌株對10種植物病原真菌活性的差異。抑菌譜初篩實(shí)驗(yàn)證明幾丁質(zhì)酶能夠增強(qiáng)野生型菌株的抑菌效果，改造后的工程菌對辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌和馬鈴薯晚疫病菌的抑制效果提升幅度較大，其中效果最顯著的是辣椒疫霉病菌。另外，從初篩結(jié)果中亦發(fā)現(xiàn)野生菌株對油菜菌核病菌（核盤菌）的抑制率能達(dá)到100％，說明Bt519-1體內(nèi)存在的某種

7、抑菌物質(zhì)能夠高效拮抗核盤菌。
　　選取兩種對Bt敏感型真菌——辣椒疫霉病菌和油菜菌核病菌作為盆栽防效評估實(shí)驗(yàn)的供試真菌，結(jié)果表明對辣椒疫霉病菌的防治上，工程菌發(fā)酵粗酶液前七天的防效最好，達(dá)到73％，比野生型提高了38％，并且持續(xù)時間長，于第十天與野生型的防效差別最顯著。油菜菌核病病葉率的溫室防效結(jié)果表明，Bt519-1與Bt519-1(pDM)發(fā)酵上清液分別能減少44.6％和58.4％的疾病發(fā)生率。另外，工程菌的IC50比野生型降