刺梨(Rosa roxburghii Tratt)抗白粉病的分子機(jī)制.pdf

1、刺梨(Rosa roxburghii Tratt)屬薔薇科薔薇屬植物。其果實(shí)肉脆、甜酸、具濃郁的特殊香味,被譽(yù)為水果中的“Vc之王”。其防癌、抑癌和抗衰老等保健作用在國內(nèi)外引起很大關(guān)注。但在人工栽培過程中,白粉病發(fā)生較為普遍,主要危害幼葉、花蕾和幼果,在溫暖濕潤的地方或季節(jié)為害更為嚴(yán)重。培育抗病優(yōu)質(zhì)品種成了果樹育種重要的方面之一,其前提是對抗病機(jī)制有較好的理解并應(yīng)用。本研究選用抗、感白粉病品種為材料,從群體生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)以及

2、病理學(xué)等角度,開展了刺梨抗白粉病分子機(jī)制相關(guān)工作。主要結(jié)果如下:
　　 1.從病理學(xué)角度研究了刺梨白粉病年發(fā)生規(guī)律和白粉菌形態(tài)結(jié)構(gòu),包括分生孢子梗的熒光觀察；分生孢子的長、寬；菌絲的直徑與隔膜；子囊孢子的長、寬；子囊果的大小等。刺梨在受到白粉菌侵襲時(shí),在菌絲周圍發(fā)現(xiàn)H2O2的迅速累積,在被侵襲部位觀察到胼胝質(zhì)的積累。刺梨的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的表達(dá)水平在白粉菌接種前后差異顯著。
　　 2.利用同源序列法克隆了刺梨抗病基因類

3、似物(Resistance Gene Aanalogues,RGAs),研究了RGA基因的序列多態(tài)性、系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳定位、與抗病位點(diǎn)關(guān)系、側(cè)翼序列信息,并與薔薇科多種果樹作物的RGA基因進(jìn)行了比較分析。從刺梨基因組中,得到了96個(gè)具有開放讀碼框架的RGA基因,其中34個(gè)RGA來源于抗病親本-貴農(nóng)6號,30個(gè)來源于感病親本-貴農(nóng)5號,32個(gè)來源于它們的F1后代。比較發(fā)現(xiàn)抗病親本和感病親本序列之間的核苷酸同源性平均值是54％,稍高于抗病親本

4、的34個(gè)序列內(nèi)部的同源性52％。系統(tǒng)進(jìn)化分析可以把這96個(gè)基因明顯分為兩大類:一類與nonTIR類型R基因同源性較高且含有該類型R基因的特異結(jié)構(gòu)域,而另一類則含有TIR類型R基因的特異結(jié)構(gòu)域。遺傳作圖把這96個(gè)基因定位到3個(gè)連鎖群:最大的含有23個(gè)標(biāo)記,命名為CR1,基因主要來源于抗病親本和F1代；第二個(gè)連鎖群CR2含有12個(gè)標(biāo)記,全部來源于感病親本；第三個(gè)連鎖群CR3有6個(gè)標(biāo)記。在第三個(gè)連鎖群檢測到一個(gè)抗白粉病QTL,離該QTL最近的

5、RGA基因?yàn)镽GA22。把這三個(gè)連鎖群中的RGA基因的位置和進(jìn)化樹的位置比較分析發(fā)現(xiàn),在一個(gè)進(jìn)化枝上的RGA基因在遺傳圖上往往也緊密“捆綁”在一起,這是由于基因的串聯(lián)重復(fù)(tandem duplication)之后序列分化造成的；另一種情況是來自明顯不同進(jìn)化枝的RGA基因在作圖時(shí)定位在一塊；形成雜合性基因簇(heterogeneous cluster),可能起源于RGA基因簇區(qū)域之間的異位重組(ecotopic recombinatio

6、n)。從親本到F1代,還觀察到了RGA基因片段缺失的現(xiàn)象,與RGA基因的減數(shù)分裂不穩(wěn)定有關(guān)。利用TAIL-PCR策略,在RGA基因側(cè)翼分離到了一個(gè)轉(zhuǎn)座子類似序列,Southern雜交分析發(fā)現(xiàn)該基因的拷貝數(shù)在抗病親本中較高,在種內(nèi),種間拷貝數(shù)有很大的差異,轉(zhuǎn)座子極有可能參與了抗病新位點(diǎn)的形成。利用已經(jīng)發(fā)表的薔薇科RGA基因,我們分析了來自刺梨、蘋果、桃、梨、草莓、杏和李等228個(gè)RGA基因,在屬間、種間進(jìn)行了比較分析,探索了RGA存在共線

7、性的可能。進(jìn)化分析還發(fā)現(xiàn)處于第125的組氨酸處于正向選擇,補(bǔ)充了產(chǎn)生抗病新位點(diǎn)的動(dòng)力。
　　 3.防衛(wèi)相關(guān)基因(Defense-related genes,DR genes)在刺梨基因組的存在形式為基因家族,各成員之間多態(tài)性多為單核苷酸(SNP)多態(tài)性,其中幾個(gè)成員響應(yīng)于白粉菌侵襲。從刺梨抗病品種-貴農(nóng)6號克隆了30個(gè)防衛(wèi)相關(guān)基因,9個(gè)PTO-like激酶基因,21個(gè)病程相關(guān)蛋白基因(Pathogenesis-related g

8、enes),其中12個(gè)PR2基因,9個(gè)PR5基因。多態(tài)性主要由單核苷酸位點(diǎn)(SNP)構(gòu)成,包括點(diǎn)突變、小插入/缺失(InDel)構(gòu)成。PR5基因平均出現(xiàn)一個(gè)SNP頻率為59 bp,PR2基因是64 bp?；赟NPs,我們開發(fā)了SNAP標(biāo)記,共設(shè)計(jì)了23對引物,最后17個(gè)標(biāo)記可以在F1群體定位。反向Northern表達(dá)分析表明,PR2數(shù)個(gè)基因在接種后的表達(dá)有所增強(qiáng),PR5基因中的一個(gè)在接種后的表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　 4.提出了刺梨

9、抗白粉病新途徑--光呼吸。首先構(gòu)建了抗白粉病相關(guān)基因富集的抑制消減(SSH)文庫,反向Northern篩選了其中的300個(gè)克隆。測序之后發(fā)現(xiàn)最為顯著的是一些光呼吸相關(guān)的基因如核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)、Rubisco激活酶、乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶、甘油醛脫氫酶、鐵氧還原蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。還有一些是已報(bào)道抗病相關(guān)的基因,如PR10、P450、泛素、STK-like kinase基因、Cf-9類似基因、LRR受

10、體類似激酶等等,轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因如NAC基因、Hisone組蛋白基因,甚至是轉(zhuǎn)座子基因。Real-Time PCR驗(yàn)證三個(gè)光呼吸相關(guān)重要基因Rubisco(命名ChrRBCs)、Rubisco激活酶(ChrRBCA)、乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因(ChrSGT)的表達(dá)明顯響應(yīng)于白粉菌接種。分光光度法檢測也證明這三個(gè)酶的活性在白粉菌接種后明顯上升。遺傳作圖發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因在刺梨基因組中聚類在一起。用RACE技術(shù)獲得了這三個(gè)基因的全長,分別為812,93