‘南通小方柿’GA2ox基因的克隆與功能分析.pdf

1、‘南通小方柿’（Diospyros kaki Linn.cv.Nantongxiaofangshi）是1982年在江蘇省進(jìn)行果樹(shù)資源普查時(shí)于南通市發(fā)現(xiàn)的珍稀矮生型柿樹(shù)品種。該品種干性弱，無(wú)明顯中心干，樹(shù)姿開(kāi)張，表現(xiàn)出明顯的矮生性狀;成年樹(shù)高僅3.5-4米，為同等條件下生長(zhǎng)的喬化品種的60％。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)‘南通小方柿’中GA2ox基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，在不同物候期的表達(dá)進(jìn)行研究，并在轉(zhuǎn)化煙草中的異位表達(dá)進(jìn)行了功能驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如

2、下:
　　1.以‘南通小方柿’幼嫩葉片為材料，通過(guò)改良的CTAB法提取總RNA，利用簡(jiǎn)并引物同源克隆出GA2ox家族中兩個(gè)基因的片段，采用RACE方法得到基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分別命名為DkGA2ox1和DkGA2ox2。兩基因的核苷酸序列與毛白楊(JX102472.1)、夾竹桃(AY594292.1)、煙草(AB125232.1)、矮牽牛(GU059939.1)蘋果(FJ571521.1)、梨(JF441168.1)、葡萄(J

3、Q608472.1)的相似度達(dá)73％～77％。含有保守20G-Fe(Ⅱ)-Oxy蛋白結(jié)構(gòu)域，高度保守的與2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)（DkGA2ox1:Arg-272、Ser-274; DkGA2ox2: Arg-271、Ser-273）和Fe2+結(jié)合位點(diǎn)(DkGA2ox1:His-205、Asp-207、His-262; DkGA2ox2: His-204、Asp-206、His-261),有著赤霉素2-氧化酶蛋白家族共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。生物信息

4、學(xué)分析DkGA2ox1和DkGA2ox2全長(zhǎng)cDNA序列為1318bp和1267bp，分別含有一個(gè)198bp和61bp的5'非翻譯區(qū)，及97bp和172bp的3'非翻譯區(qū)。編碼區(qū)編碼332個(gè)和334個(gè)氨基酸。編碼蛋白分子量分別為36596.1Da、37544.2Da，均為穩(wěn)定蛋白，無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，無(wú)明顯疏水區(qū)?；蚣易宸治鲲@示DkGA2ox1和DkGA2ox2屬于C19-GA2oxs家族。
　　2.瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建及洋蔥

5、表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，洋蔥表皮細(xì)胞的綠色熒光蛋白GFP瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示，DkGA2ox1編碼蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示DkGA2ox1和DkGA2ox2在7個(gè)典型物候期中均有表達(dá)并均高于同時(shí)期的喬化品種‘大方柿’，其中在開(kāi)花期表達(dá)量最高。表明南通小方柿中赤霉素2-氧化酶基因的表達(dá)與矮生性狀相關(guān)。
　　3.構(gòu)建了‘南通小方柿’DkGA2ox1和DkGA2ox2基因的植物雙元表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)化煙

6、草。經(jīng)GUS染色鑒定，PCR和RT-PCR對(duì)抗Hyp株系進(jìn)行檢測(cè)，獲得2個(gè)轉(zhuǎn)DkGA2ox1株系和2個(gè)轉(zhuǎn)DkGA2ox1株系。形態(tài)學(xué)鑒定表明，轉(zhuǎn)基因株系株高均與對(duì)照有極顯著差異，轉(zhuǎn)DkGA2ox1基因株系1-1、1-3的株高分別為對(duì)照的59.31％和41.54％。轉(zhuǎn)DkGA2ox2基因株系2-1、2-4的株高僅為對(duì)照植株的63.52％和32.11％。另外，轉(zhuǎn)基因株系節(jié)間距離縮短，為野生型煙草的32.23％～86.78％;莖粗增粗，比野生

7、型煙草增粗11.91％～64.99％;葉片長(zhǎng)度縮短，為野生型煙草的52.94％～76.74％;葉片寬度增大，比野生型煙草增大4.37％～30.16％; GA1+3含量下降:轉(zhuǎn)基因株系1-1、2-1的赤霉素含量?jī)H為對(duì)照的65％～70％;轉(zhuǎn)基因株系1-3、2-4的赤霉素含量為對(duì)照41％～45％;轉(zhuǎn)基因株系凈同化效率比對(duì)照上升了11.3％～33.5％，并且更為矮化的1-4、2-3均比轉(zhuǎn)同一基因的另一株系高。蒸騰速率與氣孔導(dǎo)度呈正相關(guān)，轉(zhuǎn)基因株