乙酸鉛誘導(dǎo)PC 12細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑研究.pdf

1、鉛是一種常見(jiàn)的重金屬，由于其延展性好、抗腐蝕能力強(qiáng)、熔點(diǎn)低等特性，在工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中被廣泛應(yīng)用。鉛無(wú)法被生物所降解，所以其在環(huán)境各相和生物系統(tǒng)中持續(xù)存在，造成了全球性的空氣、水、土壤鉛污染的問(wèn)題，并對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成持續(xù)性的威脅。鉛暴露能引起人體的生理、生化及行為等方面發(fā)生異常。大量的研究已證實(shí)鉛毒性可涉及到人體全身，累及神經(jīng)、血液、心血管、泌尿、生殖、骨骼、內(nèi)分泌及免疫等系統(tǒng)；其中神經(jīng)毒性由于對(duì)學(xué)齡前兒童的嚴(yán)重危害而受到更為廣泛的關(guān)注

2、。 近些年來(lái)，鉛的毒性機(jī)理也得到了較為充分的研究，發(fā)現(xiàn)鉛主要通過(guò)與蛋白結(jié)合和模擬鈣的功能產(chǎn)生毒性。最近許多研究還發(fā)現(xiàn)鉛能引起大鼠腦、睪丸、成纖維、肺和視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示細(xì)胞凋亡可能在鉛毒性中起了重要的作用。細(xì)胞凋亡是一種高度受調(diào)控的細(xì)胞死亡方式，是應(yīng)對(duì)外界刺激，維持機(jī)體平衡的重要手段。細(xì)胞凋亡的調(diào)控十分復(fù)雜，主要有三條信號(hào)途徑參與其中：死亡受體途徑、線(xiàn)粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。凋亡的信號(hào)途徑涉及了數(shù)百個(gè)基因和蛋白，從而構(gòu)成了一

3、個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞的生或死進(jìn)行精密的調(diào)控。 以往的研究中提示，線(xiàn)粒體途徑可能在鉛誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起了主要作用。然而，鉛是如何導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能失調(diào)以及哪些上游信號(hào)參與了線(xiàn)粒體途徑尚未明確。此外，鉛能擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的穩(wěn)態(tài)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是否也參與了鉛誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程尚無(wú)研究報(bào)道。 綜上所述，本研究以神經(jīng)元模式細(xì)胞-PC 12細(xì)胞為研究對(duì)象，驗(yàn)證乙酸鉛能否誘導(dǎo)PC 12細(xì)胞發(fā)生凋亡。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)已知的模式生物細(xì)胞凋亡機(jī)理逐

4、步推測(cè)線(xiàn)粒體上游途徑的參與者(如DNA損傷、p53蛋白、Bcl-2家族蛋白、細(xì)胞色素c和caspase-3等)，并用相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，最終勾畫(huà)出較為完整的鉛誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的線(xiàn)粒體途徑。此外，通過(guò)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡事件(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性的凋亡酶caspase-12和鈣蛋白酶calpain是否被激活；GRP78和CHOP表達(dá)是否發(fā)生改變等)，進(jìn)一步探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑在此過(guò)程中的作用，以期對(duì)鉛誘導(dǎo)凋亡的機(jī)理有更為全面的認(rèn)識(shí)。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

5、 1.乙酸鉛能引起PC 12細(xì)胞增殖顯著下降。 2.光鏡下觀(guān)察，乙酸鉛對(duì)PC 12細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞骨架無(wú)明顯改變。 3.電鏡下觀(guān)察，乙酸鉛能使細(xì)胞核固縮，線(xiàn)粒體腫脹、正常結(jié)構(gòu)消失并伴有空泡化，胞內(nèi)出現(xiàn)鼓泡現(xiàn)象，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見(jiàn)異常。 4.乙酸鉛能引起PC 12細(xì)胞DNA鏈斷裂，損傷程度存在濃度依賴(lài)關(guān)系。 5.乙酸鉛能誘導(dǎo)PC 12細(xì)胞發(fā)生凋亡，并存在濃度依賴(lài)關(guān)系。 6.乙酸鉛能引起caspase-3

6、活化程度顯著增強(qiáng)，并存在濃度依賴(lài)關(guān)系。 7.乙酸鉛對(duì)PC 12細(xì)胞的calpain活性無(wú)明顯改變。 8.乙酸鉛能促進(jìn)PC 12細(xì)胞胞質(zhì)細(xì)胞色素c水平的提高，Bax和p53表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)下降，Bax／Bcl-2比值上升。 9.乙酸鉛能促進(jìn)PC 12細(xì)胞GRP78表達(dá)的增加，而CHOP和procaspase-12表達(dá)未改變，caspase-12未剪切活化。 結(jié)論： 1.鉛誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的線(xiàn)粒體

7、途徑：鉛通過(guò)損傷細(xì)胞DNA誘導(dǎo)p53激活，并進(jìn)一步引起B(yǎng)ax表達(dá)增加，導(dǎo)致：Bax／Bcl-2比值升高，線(xiàn)粒體通透性改變，細(xì)胞色素c等促凋亡物質(zhì)釋放入胞質(zhì)，引起caspase級(jí)聯(lián)激活，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 2.結(jié)合形態(tài)學(xué)和生化研究結(jié)果，在本研究條件下，鉛通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑可能并未參與此過(guò)程。 3.鉛誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡生化指標(biāo)改變的同時(shí)，細(xì)胞器也發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變。 4.細(xì)胞凋亡可能在鉛致毒過(guò)程