Nrf2在潰瘍性結(jié)腸炎患者中的表達(dá)及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因尚不十分清楚的直腸和結(jié)腸慢性非特異性炎癥性疾病。其主要癥狀為腹痛、腹瀉、粘液膿血便等，主要侵犯遠(yuǎn)端結(jié)腸及直腸的粘膜層及粘膜下層，并向近端結(jié)腸擴(kuò)展，以致侵及整個(gè)結(jié)腸。近年來大量臨床資料顯示該病的發(fā)病率顯著增高。UC病程長，病變范圍廣泛，呈慢性持續(xù)性，且易癌變，越來越受到國內(nèi)外人士的廣泛重視，被WHO視為最難治的疾病之一。由于其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上至今沒有特異性的

2、根治措施。一些研究發(fā)現(xiàn)UC的抗氧化劑防御網(wǎng)絡(luò)的作用與活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）及活性氮(Reactive Nitrogen Species，RNS)的產(chǎn)生過程中的作用是不平衡的。氧化應(yīng)激引起氧自由基的大量表達(dá)，往往會(huì)導(dǎo)致脂肪、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，在UC的發(fā)病中起著重要的作用（誘導(dǎo)或加重UC），被認(rèn)為是參與腸道炎癥發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素。
　　 Nrf2(NF-E2 related fact

3、or 2)屬于CNC(cap'n'collar)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，廣泛存在于機(jī)體多個(gè)組織器官中，有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，能活化ARE而啟動(dòng)多種抗氧化反應(yīng)和解毒基因，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)多種細(xì)胞預(yù)防蛋白，對(duì)外源性有毒物質(zhì)尤其敏感，在參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的外源性有毒物質(zhì)的防御機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。Kelch樣ECH結(jié)合蛋白1(Kelch-like ECH associating protein 1，Keap1)是Nrf2的重要受體，影響Nrf2的表

4、達(dá)。生理狀態(tài)下，Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)中，與Keap1結(jié)合，處于被抑制狀態(tài)，且被泛素蛋白酶體途徑迅速降解。當(dāng)受到氧化應(yīng)激信號(hào)刺激后，Nrf2迅速與變構(gòu)的Keap1解耦連，以穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與小Maf蛋白結(jié)合形成異二聚物，再與基因中的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，增加ARE介導(dǎo)的靶基因表達(dá)，從而調(diào)控抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，如谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthetase，γ-GCS)，谷胱甘肽-s-

5、轉(zhuǎn)移酶(GST)，苯鯤還原酶1(NQO1)，UDP-葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyl transferases，UGT)，環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydrolase)等。Nrf2的激活受多個(gè)水平的調(diào)控，主要涉及Nrf2與Keap1的相互作用以及依賴于介導(dǎo)Nrf2穩(wěn)定性的機(jī)制。Nrf2從Keap1上解離有兩種機(jī)制:親核物質(zhì)或ROS的直接攻擊作用;Keap1被磷酸化的間接作用。目前一些研究認(rèn)為蛋白激酶C(PKC)、

6、促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)等途徑也參與了Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活并調(diào)控其依賴的基因的表達(dá)。此外，TauCI（?；谴茁劝罚患せ畹闹行粤＜?xì)胞中的一個(gè)產(chǎn)物）能增加Nrf2向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，增加Nrf2與ARE的結(jié)合;在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，增加的非折疊蛋白可經(jīng)由胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)途徑磷酸化Nrf2而激活Nrf2。最近多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2與炎癥性疾病關(guān)系密切，參與炎癥的發(fā)生及發(fā)展。Nrf2在大多數(shù)炎癥性

7、疾病中高表達(dá)，抑制炎癥的進(jìn)一步發(fā)展，但Nrf2與UC的嚴(yán)重程度的關(guān)系需進(jìn)一步研究。我們將就Nrf2在UC患者中的表達(dá)及對(duì)UC的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行研究。
　　 目的:檢測(cè)UC患者結(jié)腸組織中Nrf2的表達(dá)，分析Nrf2與UC病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，探討Nrf2在UC發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法:本研究共收集臨床確診為潰瘍性結(jié)腸炎患者35例（病例組）、結(jié)腸息肉患者21例（對(duì)照組=A組），抽取其清晨空腹外周靜脈血4ml、腸鏡下活檢結(jié)腸

8、粘膜組織（直-乙交界處）4塊。按照Sutherland DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者進(jìn)行評(píng)分后予以分組（輕中度組20例=B組、重度組15例=C組）。通過分光光度法檢測(cè)血清中的T-SOD活力、MDA含量，采用Western blot、免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)結(jié)腸粘膜中Nrf2的表達(dá)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，對(duì)Nrf2含量與UC嚴(yán)重程度的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、依據(jù)Sutherland DAI評(píng)分（見Table 1）及U

9、C病情活動(dòng)度Truelove和Witts分級(jí)(Table2)，將UC患者分為輕度、中度、重度3組，3個(gè)組的評(píng)分均數(shù)依次為4.5分、8.9分、11.2分。入選患者的臨床資料見Table3。
　　 2、血清中T-SOD、MDA的檢測(cè)結(jié)果
　　 2.1、病例組血清中T-SOD活力明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，且病例組中病情嚴(yán)重程度不同的組間血清中T-SOD活力也有差異，重度UC組＜輕中度UC組，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

10、＜0.01)。
　　 2.2、病例組血清中MDA含量高于對(duì)照組(P＜0.01)，且病例組中病情嚴(yán)重程度不同的組間血清中MDA含量不同，重度UC組＞輕中度UC組，任意兩組間比較:輕中度UC組與對(duì)照組比較差異不明顯，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;重度UC組與輕中度UC組、對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 3、HE染色結(jié)果:細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞漿、基底膜及膠原纖維呈粉紅色。正常人結(jié)腸粘膜上皮完整，固有層

11、內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤，腺體排列整齊;UC組粘膜彌漫性炎癥，固有層內(nèi)大量炎性細(xì)胞如嗜酸性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞浸潤，隱窩結(jié)構(gòu)紊亂、破壞，隱窩內(nèi)、隱窩上皮可見大量中性粒細(xì)胞浸潤，潘氏細(xì)胞化生，杯狀細(xì)胞減少，重度者出現(xiàn)粘膜上皮脫落。
　　 4、結(jié)腸組織中Nrf2檢測(cè)
　　 4.1、結(jié)腸粘膜Nrf2免疫組化顯示Nrf2在正常粘膜較少表達(dá)，主要位于細(xì)胞漿中，而UC組Nrf2表達(dá)明顯增多，細(xì)胞核、胞漿中均有

12、表達(dá);病例組中重度活動(dòng)組＞輕中度活動(dòng)組＞對(duì)照組，任意兩組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.2、Western blot顯示:UC各組結(jié)腸組織中Nrf2的水平高于正常對(duì)照組，P＜0.01，各組Nrf2的表達(dá)水平依次為:重度活動(dòng)組＞輕中度活動(dòng)組＞對(duì)照組。任意兩組間相比:輕中度組與對(duì)照組比較P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;重度組與輕中度組、對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 5、相關(guān)性分

13、析
　　 5.1、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)的UC組結(jié)腸組織中Nrf2的變化與其血清中T-SOD活力的變化成負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.775(P＜0.01);應(yīng)用Westernblot方法檢測(cè)的UC組結(jié)腸組織中Nrf2的變化與其血清中T-SOD活力的變化成負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.649(P＜0.01)。
　　 5.2、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)的UC組結(jié)腸組織中Nrf2的變化與其血清中MDA含量的變化成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.768(P

14、＜0.01);應(yīng)用Westernblot方法檢測(cè)的UC組結(jié)腸組織中Nrf2的變化與其血清中MDA含量的變化成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.718(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、隨著病情嚴(yán)重程度（氧化應(yīng)激水平）的進(jìn)一步增強(qiáng)，UC患者結(jié)腸粘膜組織中Nrf2的表達(dá)不斷增多，Nrf2在一定程度上可以反映UC的嚴(yán)重程度，UC的發(fā)病可能與Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)。
　　 2、兩種檢測(cè)結(jié)腸粘膜Nrf2蛋白表達(dá)的方法均顯