在人胚腎293T和惡性胃癌MGC-803細(xì)胞系中Smad-4和TGF-β對(duì)抑癌基因PTEN的調(diào)控作用.pdf

1、PTEN（與細(xì)胞骨架張力蛋白同源在腫瘤第10號(hào)染色體有缺失的磷酸脂酶基因），也叫MMAC1（在多個(gè)進(jìn)展期腫瘤中均有突變的基因），是一種抑癌基因，位于染色體10q23區(qū)，負(fù)責(zé)編碼磷酸酯酶。已發(fā)現(xiàn)在多種人類癌癥中 PTEN抑癌基因的缺失。在胃癌的PTEN基因丟失，但并未有報(bào)道此基因有高頻突變。另一方面，Smad-4是唯一共同通路型Smad(Co-Smad)蛋白，有研究認(rèn)為Smad-4作為一個(gè)抑癌基因通過(guò)TGF-β（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β）來(lái)介導(dǎo)相關(guān)

2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad-4被發(fā)現(xiàn)在胃癌等多種癌癥中丟失或發(fā)生突變。
　　在本論文中，研究了在人胚腎293T和惡性胃癌MGC-803兩種細(xì)胞系中，Smad-4和TGF-β對(duì)抑癌基因PTEN表達(dá)的調(diào)控作用。
　　通過(guò)熒光素酶雙報(bào)告基因分析，經(jīng)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Smad-4的293T細(xì)胞中PTEN基因的啟動(dòng)子活性顯著增加，表明PTEN啟動(dòng)區(qū)和SMAD-4蛋白之間存在一定的相互作用。
　　經(jīng)轉(zhuǎn)染帶有Smad-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的人胚腎293T細(xì)

3、胞，在有或無(wú)TGF-β1的情況下，都表現(xiàn)出上調(diào)PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)水平;然而，轉(zhuǎn)染Smad-4并同時(shí)用TGF-β1處理的細(xì)胞中PTEN才得以最終表達(dá)。同時(shí)，通過(guò)siRNA技術(shù)干擾Smad-4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出下調(diào)PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)的結(jié)果顯示Smad-4蛋白與PTEN啟動(dòng)子之間有三個(gè)結(jié)合作用位點(diǎn)。
　　另外，發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤中Smad-4和TGF-β的抑癌作用與正常細(xì)胞中有

4、所不同，正如很多研究中都提到過(guò)關(guān)于不同細(xì)胞系中TGF-β或Smad-4對(duì)PTEN表達(dá)調(diào)控的爭(zhēng)議問(wèn)題。對(duì)于轉(zhuǎn)染有Smad-4表達(dá)質(zhì)粒的人惡性胃癌MGC-803細(xì)胞，在有或無(wú)TGF-β1的情況下，均導(dǎo)致PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào);轉(zhuǎn)染Smad-4并同時(shí)用TGF-β處理的細(xì)胞中PTEN的表達(dá)減少。
　　許多之前的報(bào)告中提到活性RAS致癌基因及其下游在胃癌發(fā)生中的作用。本文中，先用MEK抑制劑PD98059處理MGC-803細(xì)胞

5、，之后再轉(zhuǎn)染Smad-4并施加TGF-β1信號(hào)。蛋白免疫印跡和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:細(xì)胞再次開啟了PTEN基因的表達(dá);同時(shí)經(jīng)Smad-4轉(zhuǎn)染和TGF-β信號(hào)處理，PTEN得以最大限度表達(dá)。
　　數(shù)據(jù)顯示RAS/ERK信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞中處于活化狀態(tài)，而MEK抑制劑PD98059的使用又使其被抑制。此外，分別檢測(cè)了MGC-803細(xì)胞的胞質(zhì)和核片段中Smad-4的含量，結(jié)果顯示經(jīng)MEK抑制劑處理同時(shí)施加TGF-β1信號(hào)的細(xì)胞中Sm

6、ad-4蛋白的位置改變進(jìn)入到細(xì)胞核中。因此，抑制RAS/ERK信號(hào)通路恢復(fù)了TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而實(shí)現(xiàn)Smad-4促進(jìn)PTEN的表達(dá)抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)化為表達(dá)上調(diào)。
　　綜上，在正常293T細(xì)胞中Smad-4通過(guò)TGF-β信號(hào)誘導(dǎo)PTEN的表達(dá)。然而這種調(diào)控作用在胃癌MGC-803細(xì)胞中卻是對(duì)PTEN表達(dá)的下調(diào)或是抑制作用，這可能是由于活化的RAS/ERK信號(hào)通路阻止了Smad-4的轉(zhuǎn)運(yùn)入核進(jìn)而影響對(duì)PTEN的誘導(dǎo)表達(dá)。再通過(guò)抑制RA