山莨菪堿對家兔完全性腦缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、腦復蘇是心肺復蘇后的重點和難點，而全腦缺血再灌注損傷是影響腦復蘇的關鍵。由于其發(fā)病機制復雜，目前臨床上尚缺乏足夠有效的藥物治療方法。山莨菪堿是一種良好的細胞保護劑，具有多種藥理作用，對心、肺、肝、腎、小腸等器官缺血再灌注損傷具有保護作用，但對全腦缺血再灌注損傷的保護作用缺乏系統(tǒng)研究。本研究通過觀察山莨菪堿對家兔完全性腦缺血再灌注損傷過程中腦組織游離鈣、興奮性氨基酸、脂質過氧化、線粒體功能、腦組織能量代謝、NO、ET-1、TXA2/PGI

2、2比值、神經元凋亡、腦組織超微結構及動物生存狀況的影響，旨在探討其腦保護作用機制，為臨床應用提供理論依據(jù)。 第一部分:山莨菪堿對急性完全性腦缺血及再灌注期間腦組織[Ca2+]i、興奮性氨基酸和超微結構的影響 目的：研究山莨菪堿對急性完全性腦缺血及再灌注后腦組織細胞內游離Ca2+([Ca2+]i)、興奮性氨基酸釋放及超微結構的影響。 方法：采用“閉塞雙側頸總動脈和椎動脈+體循環(huán)低血壓法”建立家兔急性完全性腦缺血再灌

3、注模型，缺血20min，再灌注2h。40只家兔隨機分為假手術組、缺血組、缺血再灌注組、治療組，治療組于再灌注前1min由股靜脈給予山莨菪堿，劑量為10mg/kg體重，繼而以微泵按5mg/h速度維持2h。采用Fura-2/Am為指示劑測定腦組織[Ca2+]i、以腦內微透析方法和高效液相色譜技術檢測神經細胞外興奮性氨基酸濃度，電鏡觀察大腦皮層超微結構。 結果：缺血組及缺血再灌注組大腦皮層神經細胞[Ca2+]i明顯高于假手術組(P＜0

4、.01)，而且缺血再灌注組[Ca2+]i明顯高于缺血組(P＜0.01)；缺血組大腦皮層神經細胞外谷氨酸、天門冬氨酸分別較假手術組升高7倍、5倍(P＜0.01)，缺血再灌注組谷氨酸和天門冬氨酸含量較缺血組明顯降低(P＜0.05)，但仍高于假手術組(P＜0.05)。隨著[Ca2+]i和興奮性氨基酸增加，腦組織超微結構損傷明顯加重，缺血組神經細胞膜呈節(jié)段性破壞，線粒體腫脹，染色質聚集；再灌注組有的神經細胞膜、線粒體膜崩解、細胞壞死，有的神經細

5、胞體積縮小，細胞器萎縮，核染色質固縮，沿核膜凝聚，出現(xiàn)凋亡。治療組于再灌注早期給予山莨菪堿治療后，腦皮質[Ca2+]i和細胞外谷氨酸、天門冬氨酸濃度較缺血組及缺血再灌注組明顯降低(P＜0.01)，同時腦組織超微結構損傷明顯減輕。 結論：山茛菪堿可通過阻斷Ca2+內流，抑制興奮性氨基酸的過度釋放，保護腦組織超微結構，減輕腦缺血再灌注損傷。 第二部分山莨菪堿對急性完全性腦缺血再灌注腦線粒體損傷和能量代謝的影響 目的：

6、研究山莨菪堿對急性完全性腦缺血及再灌注后腦線粒體呼吸功能、結構損傷和腦組織能量代謝的影響。 方法：在第一部分研究的基礎上，以差速離心法提取腦線粒體，采用氧電極法測定線粒體呼吸功能，生化法測定線粒體呼吸鏈NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細胞色素C氧化酶活性，巴比妥酸法測定線粒體丙二醛含量，酶熒光法測定腦組織ATP含量，并觀察線粒體超微形態(tài)結構。 結果：缺血組和缺血再灌注組NAD鏈和FAD鏈呼吸控制率(RCR)、磷氧比(ADP

7、/O)、氧化磷酸化率(OPR)、NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細胞色素C氧化酶活性及腦組織ATP含量均較假手術組顯著降低(p＜0.05，p＜0.01)；缺血再灌注組線粒體丙二醛(MDA)含量較假手術組及缺血組顯著升高(p＜0.01)。治療組RCR、ADP/O、OPR、呼吸酶的活性、ATP含量均較缺血組和缺血再灌注組明顯升高(p＜0.05，p＜0.01)，MDA含量較缺血再灌注組明顯降低(p＜0.01)，線粒體結構損傷減輕。 結論

8、：山茛菪堿可通過穩(wěn)定線粒體膜、抑制脂質過氧化，減輕線粒體結構損傷，并促進缺血及再灌注后線粒體呼吸功能、呼吸鏈酶活性、ATP合成能力的恢復，從線粒體水平發(fā)揮腦保護作用。 第三部分山莨菪堿對家兔急性完全性腦缺血再灌注期間NO、ET-1、TXA2和PGI2代謝的影響 目的：探討山茛菪堿對全腦缺血再灌注期間腦組織NO、ET-1、TXA2和PGI2代謝的影響。 方法：在第一部分研究的基礎上，按硝酸鹽還原酶法測定腦組織NO含

9、量，按放免法測定ET-1、TXB2、6-keto-PGF1a含量。 結果：缺血組及缺血再灌注組NO、ET-1、TXB2和6-keto-PGF1a含量明顯高于假手術組(P＜0.05，P＜0.01)，而且再灌注期間NO、ET-1和TXB2含量及TXB2/6-keto-PGF1a比值進一步升高，高于缺血組(P＜0.05，P＜0.01)。而治療組上述指標較缺血再灌注明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。 結論：山莨菪堿可通過減

10、少缺血再灌注早期NO的過量產生，抑制ET-1、TXA2合成、調節(jié)TXA2-PGI2平衡，改善腦微循環(huán)障礙，減輕腦缺血再灌注損傷。 第四部分:山茛菪堿對全腦缺血再灌注后神經元凋亡及動物生存狀況的影響 目的：探討山茛菪堿對全腦缺血再灌注遲發(fā)損傷階段神經元凋亡、動物生存狀況的影響及其抗凋亡機制。 方法：按第一部分方法建立全腦缺血再灌注損傷模型，缺血20min，再灌注24h、48h、72h，56只家兔隨機分為假手術組、缺

11、血再灌注組、治療組。采用TUNEL方法觀察皮層神經元凋亡，免疫組化法觀察皮層Caspase-3、HSP70表達，并計算動物神經功能缺陷評分(NDS)，評估動物的生存狀況。 結果：治療組于再灌注24h、48h、72hNDS均低于缺血再灌注組對應時間點(P＜0.01)。與假手術組相比，缺血再灌注組大腦皮層TUNEL陽性細胞和Caspase-3陽性細胞明顯增多，而且隨再灌注時間的延長而增多。治療組于再灌注48h、72h，TUNEL陽性

12、細胞和Caspase-3陽性細胞較缺血再灌注對應時間點顯著減少(P＜0.05，P＜0.01)。治療組HSP70免疫陽性細胞數(shù)量均明顯高于缺血再灌注組對應時間點(P＜0.05，P＜0.01)。缺血再灌注組HSP70陽性細胞于再灌注24h后即逐漸減少，而治療組HSP70陽性細胞于再灌注48h后才開始減少。 結論：山莨菪堿可抑制腦缺血再灌注損傷階段神經元凋亡，改善動物生存質量；其抗凋亡機制與抑制Caspase-3的激活和上調HSP70