低溫誘導(dǎo)的馬鈴薯塊莖特異融合啟動子的構(gòu)建及低溫調(diào)控因子St-CBF的鑒定.pdf

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物，其塊莖除用作鮮食外，還作為工業(yè)原料加工各種食品和其它淀粉產(chǎn)品，其中薯片和薯條等加工產(chǎn)品的生產(chǎn)在馬鈴薯加工業(yè)中占據(jù)重要位置。為了延長加工周期，低溫貯藏是最經(jīng)濟有效的方法，然而低溫導(dǎo)致還原糖的大量累積，使得在高溫油炸時還原糖與自由氨基酸發(fā)生褐化反應(yīng)，嚴重影響了加工產(chǎn)品的品質(zhì)。馬鈴薯油炸加工品質(zhì)改良的基因工程目前已作為重要的育種途徑在國內(nèi)外展開研究，為使目的基因在不干擾馬鈴薯正常生長而只在貯藏期間低溫誘導(dǎo)表達，低溫

2、誘導(dǎo)的塊莖特異表達啟動子成為油炸加工品質(zhì)基因工程育種的迫切需要。本研究在克隆相關(guān)低溫誘導(dǎo)表達基因啟動子的基礎(chǔ)上，構(gòu)建具有低溫誘導(dǎo)活性的塊莖特異表達融合啟動子，評價其在馬鈴薯基因工程中潛在的應(yīng)用價值。并在此基礎(chǔ)上，對馬鈴薯中調(diào)控低溫誘導(dǎo)啟動子活性的蛋白質(zhì)因子進行了初步研究，取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.低溫啟動子誘導(dǎo)活性分析：采用PCR方法分別從擬南芥和馬鈴薯中克隆了低溫誘導(dǎo)cor15a基因的啟動子和ci21A基因的啟動子。

3、序列比較分析顯示，cor15a基因的啟動子含有目前研究確定的低溫響應(yīng)元件“LTRE”，而ci21A基因的啟動子中沒有該元件。將cor15a基因啟動子和ci21A基因啟動子分別與GUS基因連接，構(gòu)建了表達載體pLB和pCI21A，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化煙草并獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色和GUS活性熒光定量分析結(jié)果顯示，cor15a基因啟動子和ci21A基因啟動子在煙草中都具有表達功能，總體表達強度分析顯示，ci21A基

4、因啟動子表達強度高于cor15a基因啟動子，但cor15a基因啟動子對低溫誘導(dǎo)的敏感性強于ci21A基因啟動子。
　　 2.cor15a基因啟動子在馬鈴薯中表達活性鑒定：為了檢測cor15a基因啟動子在馬鈴薯中是否具有低溫誘導(dǎo)活性，本研究將表達載體pLB通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯“鄂馬鈴薯3號(E3)”并獲得轉(zhuǎn)化再生植株。轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的GUS染色和GUS活性熒光定量分析結(jié)果證明，cor15a基因啟動子在馬鈴薯中仍具有低溫銹導(dǎo)表達特

5、性。在沒有低溫處理的對照組中，各被測樣品組織中均檢測不到GUS的酶活性，低溫處理后，在莖，葉，塊莖和匍匐莖組織中均可以檢測到不同強度的GUS活性，其中葉片和塊莖中的活性相對較高。
　　 3.cor15a基因啟動子和塊莖特異啟動子(CIPP)的特異核心啟動子區(qū)域表達活性鑒定：實驗將cor15a基因啟動子的-297/+70(含有一個低溫響應(yīng)元件LTRE)與GUS基因連接，構(gòu)建了轉(zhuǎn)化載體pL297-121，將CIPP啟動子的-340/

6、+19(含有塊莖特異表達調(diào)控序列TSSR)與GUS基因連接，構(gòu)建了轉(zhuǎn)化載體pC340-121。pL297-121和pC340-121分別轉(zhuǎn)化馬鈴薯E3獲得轉(zhuǎn)基因植株，分析顯示，載體pL297-121在除根以外所有被檢測的組織中均具有低溫誘導(dǎo)表達功能，但表達強度低于完整cor15a基因啟動子。pC340-121在塊莖中的表達活性明顯高于莖，根和匍匐莖，而在葉片中則始終未檢測到它的活性。同時低溫處理后，pC340-121的活性在所有被測組織

7、中均沒有變化，表明該TSSR序列的調(diào)控活性不受低溫環(huán)境的影響。
　　 4.低溫誘導(dǎo)的馬鈴薯塊莖特異啟動子構(gòu)建與表達功能鑒定：以低溫誘導(dǎo)cor15a基因的啟動子和馬鈴薯塊莖特異啟動子CIPP為基礎(chǔ)，采用重疊延伸PCR的方法，將cor15a基因啟動子中含有低溫響應(yīng)元件LTRE的-297/-42和-297/+70片段分別與CIPP啟動子中含有塊莖特異表達序列TSSR的-340/+19和-340/-28片段進行融合，按照核心序列相對于T

8、ATA-box位置的不同，構(gòu)建了2個融合啟動子pCL(TSSR靠近TATA-box)和pLC(LTRE靠近TATA-box)，并將2個融合啟動子分別與GUS基因連接，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化，將融合啟動子pCL和pLC導(dǎo)入E3獲得轉(zhuǎn)基因植株。分析結(jié)果顯示，融合啟動子pCL和pLC均具有表達功能，但核心功能序列相對于TATA-box的位置不同其表達強度具有顯著差異。塊莖特異表達序列TSSR靠近TATA-box的pCL，GUS表達強度顯著高

9、于低溫誘導(dǎo)核心啟動子序列LTRE靠近TATA-box的pLC，特別是在塊莖和匍匐莖中表現(xiàn)更為突出。
　　 5.馬鈴薯St-CBF轉(zhuǎn)錄因子的鑒定：本研究根據(jù)已報道的EST序列設(shè)計引物，采用基于PCR的技術(shù)從馬鈴薯兩個基因型(E3和CW2-1)中克隆到St-CBF基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列。序列分析顯示該片段長600bp，編碼199個氨基酸，具有CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域ERF/AP2，同時還具一個富含絲氨酸/蘇氨酸的保守區(qū)域

10、，一個核定位信號NLS(PKRPAGRKKFRETRHP)和一個保守的DSAW-Motif。該St-CBF具備CBF1/DREB1類轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。氨基酸序列比對分析表明，St-CBF與許多植物中的CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白具有較高的同源性。將St-CBF基因克隆到pGEX-6P-1上與谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶進行融合，并在大腸桿菌中BL21(DE3)中成功進行了融合蛋白的表達。凝膠阻滯實驗表明，該融合蛋白能夠與cor15a基因啟動子