特應(yīng)性皮炎的綜合高通量研究：通過OMICS手段探討疾病的核心蛋白與生物標(biāo)志物.pdf

1、目的和意義： 隨著現(xiàn)代化和工業(yè)化進(jìn)程的加快，特應(yīng)性皮炎（AD）患病率增高，是皮膚病和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。AD是一種慢性炎癥性皮膚病，易反復(fù)發(fā)作，以濕疹性皮損分布為特征。主要病理生理表現(xiàn)為苔蘚樣硬化、瘙癢性脫皮和皮膚干燥。AD是一種系統(tǒng)性功能失調(diào)性疾病，可同時(shí)觸發(fā)哮喘、過敏性鼻炎和食物過敏，伴有血漿IgE和嗜酸性粒細(xì)胞升高。因此，需要更深入的研究AD的發(fā)病機(jī)理，進(jìn)一步闡明其免疫機(jī)制。 另外本研究還進(jìn)行了分子水平的環(huán)境毒

2、理學(xué)研究。本研究以腦型肌酸激酶為模型，試圖探討小分子化合物對(duì)酶的結(jié)構(gòu)與功能影響。在了解CK-BB去折疊與再折疊過程基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)日常生活中人群接觸的頻率較高的十二烷基硫酸鈉（SDS）作用及與CK-BB結(jié)合機(jī)制進(jìn)行了探討，而且闡述了兩種可能與退行性疾病相關(guān)的環(huán)境化學(xué)物，丙烯酰胺與鋅離子，對(duì)CK-BB的結(jié)構(gòu)與功能影響的作用機(jī)制。 研究方法： 1．本研究中對(duì)患者活檢樣本、原代細(xì)胞培養(yǎng)（角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）和血清樣本中的

3、基因改變進(jìn)行研究。所有的AD樣本分為外源性（ADe）和內(nèi)源性（ADi）兩型。非特異性正常對(duì)照組（n=22），均無個(gè)人或家族史，過敏性疾病癥狀和體征，其樣本選自整形外科手術(shù)取下的皮膚。從ADe和ADi患者（n=40）皮損處取直徑3-5mm活檢樣本。20名ADe患者（SCORAD：50．09±15．68），20名ADi患者（SCORAD：46．38±11．77）。ADe組和ADi組總IgE水平、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和年齡的平均值分別為：1739 U/

4、mL，625/μL and27．4歲和105 U/mL，248/μL and28．2歲。所有樣本均取自于男性。血清按照之前報(bào)道的方法收集，等分試樣后儲(chǔ)藏在-80℃。 DNA芯片的制備按照RNA制備、標(biāo)記和雜交步驟進(jìn)行：分別準(zhǔn)備正常對(duì)照、ADe、ADi樣本，每個(gè)樣本均進(jìn)行cDNA模板合成和標(biāo)記。分別采用兩種芯片對(duì)不同樣本進(jìn)行檢測(cè)：GeneChip（）人U133 Plus2．0芯片和GenePlorer Twinchip人-8K芯

5、片。基因表達(dá)比值經(jīng)過圖像分析，并用LOWESS回歸方程標(biāo)準(zhǔn)化。應(yīng)用SAM和DEG。選擇q值（按照5%）有明顯表達(dá)差異（>2倍）的基因。GeneChip（）人U133 Plus2．0芯片用來進(jìn)行ADe和ADi皮膚組織的分析，而GenePlorer Twinchip人-8K芯片用于分析特應(yīng)性角質(zhì)形成細(xì)胞。自流電泳（FFE）和2-DE分別用于特應(yīng)性成纖維細(xì)胞和血清處理分析?；颊咴葱匝褰?jīng)多重親和移除柱（MARC）處理后進(jìn)行2-DE分析。接下來

6、，用苯基瓊脂糖樹脂分段式方法進(jìn)行AD血清蛋白質(zhì)的分析。血清經(jīng)柱子分離后TCA沉淀。 根據(jù)以上結(jié)果，可采組學(xué)工具來進(jìn)行核心基因和蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)。PPI預(yù)測(cè)使用了PPI的主要算法，包括：1）蛋白結(jié)構(gòu)相互作用使用PSIMAP（蛋白質(zhì)組圖譜），一種使用SCOP（蛋白結(jié)構(gòu)分類）數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)域的方法；2）蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)性相互作用PEIMAP（蛋白質(zhì)組圖譜），是一種普遍的使用實(shí)驗(yàn)性蛋白相互反應(yīng)信息資源的方法，如HPRD、BIND、DIP、MINT、I

7、ntAct和BioGid。 2．重組人CK-BB按照之前報(bào)道的方法進(jìn)行表達(dá)和純化。CK-BB活性測(cè)定采用ATP和肌酸反應(yīng)釋放質(zhì)子，在百里酚藍(lán)指示劑存在下，其597nm光吸收變化速率對(duì)應(yīng)于酶活性。內(nèi)源熒光和ANS結(jié)合光譜方法檢測(cè)CK-BB三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。采用圓二色譜分光光度計(jì)，在190-250nm范圍內(nèi)記錄遠(yuǎn)紫外圓二色譜（CD）光譜檢測(cè)CK-BB二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。等溫滴定微量量熱法采用3101TAMⅢ恒溫箱按照之前報(bào)道的方法進(jìn)行測(cè)量

8、。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲得已知的CK-BB同源性結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)同系物牛的視黃醛肌酸激酶A鏈（PDB編碼：1g0w）是一個(gè)良好的CK-BB結(jié)構(gòu)模板（含97%相同序列）。結(jié)合模擬操作分為：1）計(jì)算相應(yīng)的受體和3D配體，2）對(duì)接大小特征，3）計(jì)算網(wǎng)格評(píng)分，4）決定補(bǔ)充受體和配體對(duì)接。 結(jié)果 1．Affymetrix芯片檢測(cè)出406種差異表達(dá)基因（DEG），在正常人和AD患者（ADe和ADi）之間，鑒別出130個(gè)DEG；在正常

9、人和ADe患者之間，鑒別出327個(gè)DEG；在正常人和ADi患者之間，鑒別出146個(gè)DEG。8K cDNA芯片結(jié)果顯示在原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞AD疾病中有157個(gè)基因失調(diào)。接下來，通過FFE在AD成纖維細(xì)胞中獲得93個(gè)候選基因。MARC處理后的AD血清樣本檢測(cè)到30個(gè)上調(diào)蛋白質(zhì)和19個(gè)下調(diào)蛋白質(zhì)。改進(jìn)分段方法，檢測(cè)到9個(gè)失調(diào)基因。Affymetrix芯片分析利用PSIMAP和PEIMAP兩種不同的生物信息學(xué)計(jì)算方法得到5個(gè)和8個(gè)核心基因，

10、分別是：PIK3R1、IGFIR、MAPK13、SFN、YWHAE和CORIN、COL14A1、CLCA4、PTPRC、IL10RA、CIS、PHLPP、SLITRK6。應(yīng)用8K cDNA芯片在角質(zhì)形成細(xì)胞中找出25個(gè)基因。通過FFE在AD成纖維細(xì)胞中4個(gè)核心蛋白在PSIMAP和PEIMAP算法中均檢測(cè)到，即：I55423、ARR3、YWHAE和EEF1A1。AD血清樣本的2-DE結(jié)果中發(fā)現(xiàn)26種蛋白質(zhì)。AD組織中SFN和PTPRC經(jīng)實(shí)

11、時(shí)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的SFN在ADi中上調(diào)4．5倍，PTPRC在ADe和ADi中分別下調(diào)60%和46%。ELISA結(jié)果顯示，MMP1和MMP10在ADi患者中均上調(diào)。ADi患者血清的ELISA研究結(jié)果表明，與正常人和ADe患者相比較，MMP1和MMP10顯著上調(diào)（幾乎兩倍），均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，采用隨機(jī)配對(duì)和Wilcoxon檢測(cè)。 2．對(duì)SDS使CK-BB的折疊后的失活進(jìn)行了研究。SDS能非競爭性抑制CK-BB的活

12、性（Ki=1．22 mM）。SDS與CK-BB暴露的疏水表面結(jié)合誘導(dǎo)其三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。SDS配體結(jié)合熱力學(xué)參數(shù)的改變?nèi)珈?、吉布斯自由能和熵分別為-13±7．0MJ/mol，8．39 kJ/mol and-42．754 kJ/（K·mol）。研究明確了重要的CK-BB結(jié)構(gòu)以及和SDS相互反應(yīng)的折疊和抑制動(dòng)力學(xué)信息。預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)具有0．51 A的均方根偏差。CK-BB與SDS之間對(duì)接成功，具有顯著性評(píng)分（-4．67 kcal/mol，自動(dòng)對(duì)接

13、4和-48．32 kcal/mol，DOCK6）。丙烯酰胺對(duì)腦型肌酸激酶（CK-BB）的抑制效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，CK-BB能被動(dòng)態(tài)的失活并伴隨疏水表面的暴露。丙烯酰胺主要與CK-BB的硫氫基（-SH）殘基相互作用導(dǎo)致烷化。計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接支持丙烯酰胺直接結(jié)合到CK-BB的活性位點(diǎn)上，主要與CYS74和GLY73殘基相互作用。Zn2+通過劑量依賴效應(yīng)失活CK-BB（IC50=0．06 mM）。Zn2+顯著誘導(dǎo)CK-BB疏水基表面破裂導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)改

14、變。還發(fā)現(xiàn)Zn2+能使CK-BB發(fā)生聚沉。聚沉依賴于溫度以及酶和Zn2+的濃度。 結(jié)論 1．為了更深入了解AD發(fā)病機(jī)制，明確在AD病情發(fā)展中有多少基因起作用，進(jìn)行了大規(guī)模的微陣列研究，得到許多新的相關(guān)信息。結(jié)果主要集中在AD相關(guān)基因大規(guī)模DNA芯片研究的描述上，這將為全面了解AD疾病提供新的見解，但是結(jié)果中尚不包括詳細(xì)的功能研究。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了AD皮膚組織的研究并檢測(cè)到了核心基因。然后進(jìn)行角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的

15、研究。同時(shí)還對(duì)AD患者血清中蛋白質(zhì)差異表達(dá)進(jìn)行了研究。已知多種因子參與了AD的發(fā)病，不同的患者中存在多種觸發(fā)因素，本研究數(shù)據(jù)提示人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞活化在AD疾病中起作用。然而，在原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)或基因可能提示著體內(nèi)也存在相應(yīng)的蛋白質(zhì)變化，但是mRNA水平和表達(dá)的蛋白質(zhì)水平之間的差異干擾了對(duì)AD中準(zhǔn)確作用的理解。 大規(guī)模的芯片研究結(jié)果能有助于深入了解AD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜的相關(guān)因素。結(jié)

16、合表達(dá)數(shù)據(jù)分析和蛋白質(zhì)相互作用組預(yù)測(cè)能找到更可靠的與AD疾病相關(guān)的基因。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)相互作用配體和核心蛋白能為下一步AD治療的功能研究提供有效、可靠的靶點(diǎn)。AD患者數(shù)量迅速增多，急需找到特異性診斷和敏感性治療方法。因此，OMICS手段的應(yīng)用改善了對(duì)AD皮膚組織的表達(dá)形式以及組分如角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的研究。根據(jù)本研究，得出以下結(jié)論：1）生物信息學(xué)工具結(jié)合HTS數(shù)據(jù)篩選新的核心基因或蛋白，在今后的功能學(xué)研究和臨床藥物開發(fā)中將發(fā)揮重要作

17、用；2）本研究中發(fā)現(xiàn)多個(gè)在AD源性樣本中表達(dá)顯著改變的重要基因，如SFN、PTPRC、MMP1和MMP10，可能是AD疾病的生物學(xué)標(biāo)記；3）本研究中預(yù)測(cè)出的大部分核心蛋白、以及實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)出的候選基因/蛋白在之前關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的研究中未見報(bào)道；4）結(jié)合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和相互作用組分析方法等研究手段將有助于AD復(fù)雜病理機(jī)制的研究，以及準(zhǔn)確的生物標(biāo)記物或臨床治療靶點(diǎn)的探測(cè)。 2．本部分研究我們以腦型肌酸激酶（CK-BB）為模

18、型，探討了小分子工業(yè)化學(xué)物通過影響酶的結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)蛋白質(zhì)錯(cuò)去折疊，導(dǎo)致酶的失活以及聚沉的毒理途徑。不管是SDS（兩親變性劑），丙烯酰胺（巰基加合物），還是Zn2+（金屬離子），都可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)疏水表面的暴露。尤其是Zn2+促發(fā)CK-BB發(fā)生聚沉。這種由小分子化學(xué)物誘發(fā)的聚沉現(xiàn)象在許多退行性病變中可能具有重要的意義，其確切的病理價(jià)值有待進(jìn)一步深入研究。環(huán)境中存在大量的具有慢性神經(jīng)毒作用的工業(yè)化學(xué)品。這些小分子化學(xué)物是否具有協(xié)同作用，誘