香葉木素通過(guò)調(diào)控p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期G2-M期阻滯.pdf

1、[目的]
　　1.驗(yàn)證香葉木素(diosmetin)在誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)凋亡中的作用。
　　2.驗(yàn)證細(xì)胞色素氧化酶（CYP1A酶）參與香葉木素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程。
　　3.探討香葉木素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期G2/M期阻滯是否與p53信號(hào)通路有關(guān)。
　　[方法]
　　體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、RT-PCR、Western blotting、 EL

2、ISA實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)CYP1A酶表達(dá)量。MTT檢測(cè)香葉木素對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率，流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)檢測(cè)周期阻滯及細(xì)胞凋亡率。Western blotting檢測(cè)G2/M期檢測(cè)點(diǎn)相關(guān)p53信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況。同樣方法檢測(cè)加入p53抑制劑(PFT-α)后p53信號(hào)通路蛋白表達(dá)及G2/M期周期阻滯情況。
　　[結(jié)果]
　　1.倒置顯微鏡下觀察不同濃度(0ug/ml、5ug/ml、10 ug/ml、20 ug/ml)香葉木素處理后He

3、pG2細(xì)胞形態(tài)變化，未加藥處理組細(xì)胞輪廓清晰且長(zhǎng)勢(shì)良好，加藥組細(xì)胞變圓、漂浮數(shù)量增多，且隨藥物濃度增高細(xì)胞形態(tài)變化越來(lái)越明顯。
　　2.MTT數(shù)據(jù)結(jié)果顯示香葉木素在一定濃度范圍內(nèi)顯著抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖活性，效應(yīng)存在明顯的時(shí)效和量效關(guān)系。
　　3.流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)數(shù)據(jù)顯示，香葉木素主要通過(guò)阻滯HepG2細(xì)胞周期G2/M期來(lái)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)凋亡率具有濃度依賴性。
　　4.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:CY

4、P1A1、CYP1A2酶在HepG2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)量較高，CYP1A1酶在5ug/ml香葉木素處理后的HepG2細(xì)胞中的表達(dá)量有差異，而CYP1A2酶在此濃度表達(dá)量無(wú)差異，但10ug/ml、20 ug/ml香葉木素處理后與對(duì)照組比較有明顯差異。
　　5.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果提示:CYP1A酶參與香葉木素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程，且HepG2細(xì)胞中CYP1A1酶的表達(dá)量較CYP1A2酶的表達(dá)量高。
　　6.間接免疫熒光

5、結(jié)果:CYP1A酶主要存在于HepG2細(xì)胞胞質(zhì)中，20ug/ml香葉木素處理24小時(shí)后CYP1A酶表達(dá)量明顯升高。
　　7.蛋白免疫印跡:香葉木素處理后CYP1A1/CYP1A2表達(dá)量升高，細(xì)胞周期G2/M DNA損傷信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量發(fā)生變化: p53、p21、MDM2、chk2上調(diào)，cdc2、CyclinB、cdc25A下調(diào)。此外，發(fā)現(xiàn)MAPK途徑中的p-ERK、p-JNK均下調(diào)。最重要的是，G2/M期阻滯，p53上調(diào)，p