腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對胚鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)揮保護作用的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制.pdf

1、大量研究表明缺氧是造成神經(jīng)元死亡的重要原因之一，宮內(nèi)缺氧可致胎兒宮內(nèi)窘迫而損傷腦細胞，造成生長發(fā)育遲緩，同時因累及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的多個區(qū)域而遺留永久性的損傷，成活者常遺留腦癱、智力低下等嚴(yán)重后遺癥。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-dedved neurotrophic factor，BDNF)作為腦組織中含量最豐富的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)合成并廣泛存在于腦組織，包括大腦皮層、海馬、基底前腦、紋狀體、下丘腦和小腦，其中以海馬和皮層

2、中含量最高。BDNF通過其特異性受體酪氨酸激酶(TrkB)參與細胞的分化、粘著、增殖與成熟等重要的生物學(xué)過程。目前已有大量研究表明，在腦外傷、低血糖、腦缺血、腦缺氧及抽搐損傷時，細胞內(nèi)BDNF及其受體TrkB的表達均受到明顯影響，加入外源性BDNF可有效減輕神經(jīng)元所受損傷。 我們前期已用多種試驗方法證明了BDNF對缺氧胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元有確切保護作用，但BDNF與TrKB結(jié)合后將胞外刺激信號傳遞入核內(nèi)的機制尚未完全明確。BDNF

3、細胞內(nèi)信號傳遞途徑主要有兩條，即絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路和磷酯酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI-3-K)／AKT信號通路。在大多數(shù)情況下MAPK途徑是BDNF發(fā)揮作用的優(yōu)勢途徑，對細胞存活起著重要的調(diào)節(jié)作用。MAPK家族主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-related kina

4、se，ERKl／2)、P38MAPK、c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)。ERK1／2通路主要由生長因子及絲裂原激活后在各種神經(jīng)元損傷和在細胞應(yīng)激反應(yīng)中起保護作用；而P38MAPK和JNK則主要在一系列應(yīng)激及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促細胞凋亡及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。 目前對BDNF神經(jīng)元保護作用的細胞內(nèi)信號傳遞機制國際上尚存在爭論：有研究者認(rèn)為MAPK／ERK信號通路是BDNF發(fā)揮其保護作用的

5、主要通路，但另有一些研究者對這一觀點提出異議，甚至發(fā)現(xiàn)激活該信號通路不僅不能對細胞起到保護作用，反而可促進細胞死亡。亦有人提出磷酯酰肌醇—3—磷酸酶／AKT(PI-3-K／AKT)通路是啟動BDNF神經(jīng)元保護作用的主要通路。亦有研究發(fā)現(xiàn)BDNF可同時激活MAPK／ERK信號通路和PI-3-K／AKT信號通路。BDNF激活的主要信號通路可因神經(jīng)細胞類型、培養(yǎng)條件及細胞受損方式的不同而不同。本研究在體外培養(yǎng)出高純度胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的基礎(chǔ)上，

6、成功建立急性神經(jīng)元缺氧模型，采用免疫熒光法、MTT比色法、Western Blot等檢測方法探討B(tài)DNF對體外培養(yǎng)神經(jīng)元缺氧保護作用的細胞內(nèi)信號傳遞機制。 主要結(jié)果如下： 1．體外培養(yǎng)出高純度胚鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元。采用神經(jīng)元標(biāo)志物Tubulin βⅢ和神經(jīng)膠質(zhì)細胞標(biāo)志物GFAP對神經(jīng)元進行免疫熒光鑒定，星形膠質(zhì)細胞沾染率<5％。 2．成功建立體外神經(jīng)元細胞急性缺氧模型。動態(tài)觀察在不同缺氧時間點(0小時—24小時

7、)神經(jīng)元細胞的形態(tài)學(xué)變化。缺氧8小時組神經(jīng)元絕大部分死亡，細胞崩解現(xiàn)象加劇，細胞脆片增多。 3．用U0126、LY294002及SB203580分別阻斷相應(yīng)的ERK信號通路，PI-3-K通路及P38MAPK通路后，采用MTT比色法檢測各組神經(jīng)元細胞活性，發(fā)現(xiàn)U0126、LY294002能夠明顯減弱BDNF對缺氧神經(jīng)元的保護作用，而SB203580亦可減弱BDNF的保護作用。 4．應(yīng)用WestemBolt方法對三條通路即E

8、RK通路，PI-3-K通路及P38MAPK通路進行檢測，發(fā)現(xiàn)加入BDNF后缺氧神經(jīng)元磷酸化ERK、磷酸化AKT及兩條通路下游的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子磷酸化CREB表達明顯增強，而磷酸化P38MAPK則未見表達。 5．采用免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn)加入BDNF后缺氧神經(jīng)元內(nèi)磷酸化ERK出現(xiàn)核內(nèi)轉(zhuǎn)位，而且磷酸化CREB的核內(nèi)表達增強。 以上結(jié)果提示，BDNF可同時激活ERK通路及P13K通路來發(fā)揮其對缺氧神經(jīng)元的保護作用。但究竟其中哪條通路