三型腫瘤壞死因子alpha條件性表達載體的構(gòu)建及其表達.pdf

1、腫瘤壞死因子α(Tumour necrosis factor alpha,TNF-α)是一種具有多樣生物學功能的細胞因子,其以26kD跨膜形式表達在細胞表面,稱跨膜型TNF-α(transmembrane TNF-α,tmTNF-α)。tmTNF-α經(jīng)TNF-α轉(zhuǎn)化酶(TNF-α converting enzyme,TACE)剪切,釋放其胞外段而成為17kD分泌型TNF-α(secretory TNF-α,sTNF-α)。本實驗室前期研

2、究證實tmTNF-α與sTNF-α在炎癥中起著不同的作用,sTNF-α主要通過TNFR1發(fā)揮促炎作用,而tmTNF-α可能主要通過TNFR2發(fā)揮抑炎作用。
　　為了更加深入的研究兩型TNF-α在非可控性炎癥惡性轉(zhuǎn)化為腫瘤過程中所起的所用及其機制,我們構(gòu)建了野生型、跨膜型和分泌型TNF-α條件性表達載體,進行體外表達并用以制備轉(zhuǎn)基因小鼠,為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建三型TNF-α條件性表達載體:

3、
　　通過分子生物學的方法將野生型wtTNF-α、跨膜型tmTNF-α和分泌型sTNF-αcDNA片段插入到條件性表達載體pBSA-IRES-GFP中,經(jīng)測序等方法證實成功構(gòu)建pBSA-wttnf-IRES-GFP,pBSA-tmtnf-IRES-GFP,pBSA-stnf-IRES-GFP三種TNF-α條件性表達載體。
　　2.構(gòu)建CRE真核表達載體:
　　為驗證三型TNF-α條件性表達載體的真核表達,構(gòu)建CRE真核

4、表達載體。利用PCR從CMV-CRE轉(zhuǎn)基因小鼠基因組DNA中釣取CREDNA片段,并將之插入到真核表達載體pcDNA3.1中,經(jīng)測序等方法證實成功構(gòu)建pcDNA-CRE真核表達載體。
　　3.體外條件性表達三型TNF-α:
　　將pcDNA-CRE分別與上述三種TNF-α條件性表達載體共轉(zhuǎn)染,通過流式細胞術(shù)證實pBSA-wttnf-IRES-GFP或pBSA-tmtnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細胞表達tmTNF-α明顯高于p

5、BSA-stnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細胞;并且三種共轉(zhuǎn)染組均較高表達綠色熒光。而單轉(zhuǎn)染pBSA-wttnf-IRES-GFP、pBSA-tmtnf-IRES-GFP、pBSA-stnf-IRES-GFP及pcDNA-CRE的細胞未檢測到tmTNF-α及綠色熒光表達。此外,用ELISA證實pBSA-wttnf-IRES-GFP或pBSA-stnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細胞分泌sTNF-α明顯高于pBSA-tmtnf-IRES-GFP

6、共轉(zhuǎn)染細胞,提示野生型TNF-α基因表達兩型TNF-α,跨膜型TNF-α突變體僅表達tmTNF-α,分泌型TNF-α突變體則僅表達sTNF-α。
　　4.MTT證實sTNF-α的殺傷效應:
　　利用MTT分別檢測CRE與上述三型TNF共轉(zhuǎn)染細胞上清對L929細胞的殺傷效應。結(jié)果顯示pBSA-wttnf-IRES-GFP或pBSA-stnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細胞上清的殺傷率明顯高于pBSA-tmtnf-IRES-GFP共

7、轉(zhuǎn)染組,并且其殺傷作用能被TNF-α特異性抗體所封閉。而單轉(zhuǎn)染pBSA-wttnf-IRES-GFP、pBSA-tmtnf-IRES-GFP、pBSA-stnf-IRES-GFP及pcDNA-CRE細胞上清對L929細胞幾乎無殺傷作用。
　　5.MTT證實tmTNF-α的殺傷效應:
　　用MTT分別檢測CRE與上述三型TNF共轉(zhuǎn)染細胞,觀察這些效應細胞對L929細胞的殺傷效應。結(jié)果顯示pBSA-wttnf-IRES-GFP或

8、pBSA-tmtnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細胞對L929細胞殺傷率明顯高于pBSA-stnf-IRES-GFP共轉(zhuǎn)染細胞,且其殺傷活性能被TNF-α特異性抗體所封閉。但單轉(zhuǎn)染pBSA-wttnf-IRES-GFP、pBSA-tmtnf-IRES-GFP、pBSA-stnf-IRES-GFP及pcDNA-CRE細胞對L929細胞無明顯胞毒效應。
　　6.獲得野生型TNF轉(zhuǎn)基因小鼠:
　　將構(gòu)建成功的質(zhì)粒委托給廣州賽業(yè)公司,經(jīng)

9、過基因組PCR驗證表明已成功制備野生型TNF轉(zhuǎn)基因小鼠。將轉(zhuǎn)基因小鼠與全身廣泛表達CRE的CMV-CRE轉(zhuǎn)基因小鼠交配,2窩共獲F1代14只,經(jīng)基因組PCR證實其中4只小鼠獲得TNF基因,但CRE基因陰性;8只小鼠獲得CRE基因,但TNF基因陰性;其余2只小鼠則為雙陰性,尚未獲得雙基因陽性小鼠。另外兩個品系(pBSA-tmtnf-IRES-GFP,pBSA-stnf-IRES-GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠正在制備中。
　　本研究結(jié)果為深入研