輸尿管完全梗阻大鼠腎臟不可逆損傷差異蛋白質(zhì)的篩選和鑒定.pdf

1、目的：
　　蛋白質(zhì)組學(xué)可動態(tài)、整體、定量地觀察梗阻性腎病發(fā)生、發(fā)展中蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的改變，結(jié)合功能蛋白質(zhì)組的研究，依托雙向電泳和質(zhì)譜分析的體系和生物功能信息分析，有希望找到調(diào)控腎臟不可逆損傷進(jìn)程關(guān)鍵作用的蛋白分子。本研究擬采用雙向電泳分離單側(cè)輸尿管完全梗阻（complete unilateral ureteralobstruction CUUO）腎臟組織與正常對照腎臟組織的總蛋白質(zhì)，建立雙向電泳圖譜，尋找表達(dá)差異點，通過質(zhì)譜分析

2、鑒定，確定與腎臟不可逆損傷發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)。并采用Real-time PCR、免疫組化/免疫熒光及Western blot方法在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平對其在動物模型及腎積水患兒腎臟組織中的表達(dá)差異進(jìn)行驗證，分析其與細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激作用的關(guān)聯(lián)性。以期通過此研究，為進(jìn)一步揭示梗阻性腎病的發(fā)病機(jī)制，尋找腎臟不可逆損傷有意義的生物學(xué)標(biāo)記物及治療的靶點，提供新的線索和思路。
　　方法：
　　1、將2月齡SD(Sprague-

3、Dawley rat)大鼠隨機(jī)分成CUUO12h、CUUO24h、CUUO72h和正常對照組，共4組，每組各6只，取腎臟組織，應(yīng)用雙向電泳及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)，尋找CUUO動物模型腎臟組織在不同梗阻時間點差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　2、應(yīng)用Real-time PCR、免疫組化及Western blot方法在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平對ANXA4和PRDX1在動物模型腎臟組織中的表達(dá)差異進(jìn)行驗證。
　　3、應(yīng)用Real-time P

4、CR、免疫熒光及Western blot方法在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平對ANXA4和PRDX1在6例腎積水患兒腎臟組織及6例腎胚瘤患兒瘤旁正常腎臟組織中的表達(dá)差異進(jìn)行驗證。
　　4、用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗組與對照組間比較采用兩樣本的t檢驗，實驗組組間比較采用ANOVE檢驗，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1、CUUO腎臟組織與正常對照組腎臟組織的雙向電泳圖譜分辨率高、

5、重復(fù)性好。選擇表達(dá)差異2倍以上的69個點，經(jīng)質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索成功鑒定出39個蛋白，結(jié)合生物功能信息分析，涉及細(xì)胞凋亡、線粒體能量代謝及線粒體損傷、氧化應(yīng)激等多方面。
　　2、對鑒定出的差異蛋白進(jìn)行了生物功能信息分析，選擇確定梗阻性腎病相關(guān)蛋白候選分子ANXA4和PRDX1進(jìn)行深入研究。
　　動物模型中，免疫組化結(jié)果顯示ANXA4在腎小管細(xì)胞胞漿和胞膜中高表達(dá)，呈棕黃色，平均光密度值在正常對照組為0.0986±0.0

6、237，CUUO12h組為0.1322±0.0228，CUUO24h組為0.1466±0.0179，CUUO72h組為0.1505±0.0201;Real-time PCR結(jié)果顯示ANXA4 mRNA的表達(dá)在CUUO12h組是正常對照組的1.17倍，在CUUO24h組是正常對照組的1.41倍，在CUUO72h組是正常對照組的1.48倍;Western blot結(jié)果顯示ANXA4的相對強(qiáng)度在正常對照組為0.6411±0.0092，CUUO

7、12h組為0.7166±0.0364，CUUO24h組為0.9182±0.0137，CUUO72h組為1.0654±0.0324; ANXA4在CUUO各組與正常對照組相比有顯著差異，CUUO組組間相比有顯著差異，P＜0.05。
　　免疫組化結(jié)果顯示PRDX1在腎小管細(xì)胞胞漿中高表達(dá)，呈棕黃色，平均光密度值在正常對照組為0.1062±0.0229，CUUO12h組為0.1384±0.0209，CUUO24h組為0.1196±0.0

8、141，CUUO72h組為0.1146±0.0258; Real-time PCR結(jié)果顯示PRDX1 mRNA的表達(dá)在CUUO12h組是正常對照組的1.37倍，CUUO24h組是正常對照組的1.03倍，CUUO72h組是正常對照組的1.07倍;Western blot結(jié)果顯示PRDX1的相對強(qiáng)度在正常對照組為0.7124±0.0710，CUUO12h組為0.9484±0.0635，CUUO24h組為0.7424±0.0626，CUUO7

9、2h組為0.7551±0.0209; PRDX1在CUUO12h組與CUUO24h、CUUO72h及對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。
　　3、免疫熒光結(jié)果顯示ANXA4在腎積水患兒腎臟腎小球及腎小管細(xì)胞胞漿和胞膜中同時有表達(dá)，熒光面積值在正常對照組為0.0455±0.0045，在腎積水組為0.0676±0.0017; Real-time PCR結(jié)果顯示ANXA4 mRNA的表達(dá)在腎積水組是正常對照組的1.14倍;West

10、ern blot結(jié)果顯示ANXA4的相對強(qiáng)度在正常對照組為0.9667±0.0075，在腎積水組為1.0259±0.0186; ANXA4在腎積水組與正常對照組相比有顯著差異，p＜0.05。
　　免疫熒光結(jié)果顯示PRDX1在腎小球及腎小管細(xì)胞胞漿中同時有表達(dá)，熒光面積值在正常對照組為0.38±0.0282，在腎積水組為0.52±0.02; Real-time PCR結(jié)果顯示PRDX1 mRNA的表達(dá)在腎積水組是正常對照組的1.10

11、倍;Western blot結(jié)果顯示PRDX1的相對強(qiáng)度在正常對照組為1.2316±0.0141，在腎積水組為1.3487±0.0116;PRDX1在腎積水組與正常對照組相比有顯著差異，p＜0.05。
　　結(jié)論：
　　1、運用雙向電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析及生物功能信息分析篩選并鑒定出的39個差異蛋白質(zhì)可能與梗阻性腎病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。
　　2、應(yīng)用Real-time PCR、免疫組化/免疫熒光及Western blot技術(shù)