3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗相關(guān)miRNAs的篩選及功能研究.pdf

1、第一部分miRNAs在3T3-L1脂肪細(xì)胞和胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中的差異表達(dá) 目的： 1.探討正常3T3-L1脂肪細(xì)胞和胰島素抵抗（insulinresistance，IR）脂肪細(xì)胞中微小RNA（miRNAs）的表達(dá)是否存在差異。 2.篩選幾個(gè)可能與IR相關(guān)的miRNAs，尋找其靶基因，以進(jìn)一步研究miRNAs在IR中的作用。 方法： 1.IR脂肪細(xì)胞模型的建立：采用高糖/高胰島素處理3T3-L1脂

2、肪細(xì)胞24小時(shí)，通過葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)和[3H]葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)判斷模型是否建立。 2.miRNAs的差異表達(dá)：運(yùn)用miRNAs芯片技術(shù)檢測3T3-L1脂肪細(xì)胞和IR脂肪細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs。 3.IR相關(guān)的幾個(gè)miRNAs及其靶基因的篩選：根據(jù)基因芯片結(jié)果，對(duì)顯著變化的某些miRNAs進(jìn)行分析，篩選幾個(gè)可能與IR相關(guān)的miRNAs及其調(diào)控的靶基因。 結(jié)果： 1.IR脂肪細(xì)胞模型的建立高糖/高胰島素分別

3、使3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量和[3H]葡萄糖攝取率下降75％和161％，與脂肪細(xì)胞組相比差異有顯著性，結(jié)果表明IR脂肪細(xì)胞模型成立。 2.miRNAs芯片分析miRNAs芯片結(jié)果顯示：miRNAs在IR脂肪細(xì)胞中比在脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平升高2倍以上者有50個(gè)，表達(dá)水平降低至1/2以下者有29個(gè)；且miR-320上調(diào)最明顯，miR-21下調(diào)最明顯。 3.IR相關(guān)的幾個(gè)miRNAs及其靶基因應(yīng)用生物信息學(xué)方法，我們選取了

4、3個(gè)可能與IR相關(guān)的miRNAs（miR-320，298和miR-21）進(jìn)行下一步的功能實(shí)驗(yàn)，Pik3r1可能是他們的靶基因。 結(jié)論： 1.高糖和高胰島素可誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生IR。 2.脂肪細(xì)胞和IR脂肪細(xì)胞中存在miRNAs的差異表達(dá)。 第二部分miRNAs對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制 目的： 1.針對(duì)miR-320和miR-298設(shè)計(jì)相應(yīng)的反義寡核苷

5、酸（AMO-miR-320，AMO-miR-298），同時(shí)構(gòu)建含miR-21前體的重組質(zhì)粒（pSilencer3.1-miR-21）。以脂質(zhì)體為載體介導(dǎo)，觀察AMO-miR-320，AMO-miR-298及pSilencer3.1-miR-21對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞和IR脂肪細(xì)胞糖代謝的影響。了解這3個(gè)miRNAs在正常和病理狀況下有無促進(jìn)葡萄糖攝取和改善IR的作用。 2.對(duì)能改善脂肪細(xì)胞IR的miRNAs，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制

6、。 方法： 1.miRNAs對(duì)正常及IR脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的影響。 2.miRNAs對(duì)正常及IR脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響。 3.miRNAs對(duì)IR脂肪細(xì)胞PI-3K、Akt、GLUT4的表達(dá)和GLUT4轉(zhuǎn)位的影響。 結(jié)果： 1.miRNAs對(duì)正常3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗和攝取的影響：基礎(chǔ)狀態(tài)下，3種miRNAs對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗和攝取無顯著性影響；在100nmol/L胰

7、島素存在的條件下，各組脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗和攝取都顯著增加，分別是基礎(chǔ)狀態(tài)下的2.2-2.3倍和4.2-4.4倍，但組間無顯著性差異。 2.miRNAs對(duì)IR脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗和攝取的影響：基礎(chǔ)狀態(tài)下，IR組和脂肪細(xì)胞組葡萄糖消耗量和攝取率無顯著性差異。在100nmol/L胰島素存在下，與脂肪細(xì)胞組相比，IR組葡萄糖消耗量和攝取率顯著下降；與IR組比較，AMO-miR-320+IR組和pSilencer3.1-miR-21+I

8、R組葡萄糖消耗量分別增加了18.5％和14.9％（P<0.05），葡萄糖攝取率分別增加了57.3％和46.2％（P<0.05）；其他各組與IR組相比，葡萄糖消耗量和攝取率無顯著性差異。 3.miRNAs對(duì)IR脂肪細(xì)胞PI-3K、Akt、GLUT4的表達(dá)和GLUT4轉(zhuǎn)位的影響：Western-blot顯示：與脂肪細(xì)胞組相比，IR組PI3Kp85蛋白表達(dá)和Akt絲氨酸磷酸化水平分別下降了42.7％和54.8％；AMO-miR-320

9、和miR-21可完全恢復(fù)IR脂肪細(xì)胞PI3Kp85表達(dá)；同時(shí)使IR脂肪細(xì)胞Akt絲氨酸磷酸化水平分別提高28.5％和33.9％。此外，IR組較脂肪細(xì)胞組GLUT4蛋白表達(dá)顯著下降51.1％， 結(jié)論： 1.AMO-miR-320和miR-21可促進(jìn)IR脂肪細(xì)胞糖代謝、改善IR。 2.AMO-miR-320和miR-21可能是通過作用PI3KP85和PI3KP85上游基因，提高Akt絲氨酸磷酸化水平，促進(jìn)GLUT4的

10、轉(zhuǎn)位來發(fā)揮改善IR的作用。 第三部分脂肪細(xì)胞分化過程中miRNAs差異表達(dá)及功能研究 目的： 1.探討3T3-L1前脂肪細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞（MSC）分化成脂肪細(xì)胞過程中差異表達(dá)的miRNAs。 2.觀察miR-320、miR-21和miR-375對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的影響；對(duì)能影響脂肪細(xì)胞分化的miRNAs，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。 方法： 1.脂肪細(xì)胞分化過程中miRNAs的差異表達(dá)。

11、 2.脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的miRNAs的篩選及其靶基因的預(yù)測。 3.miR-21和miR-375對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響。 4.AMO-miR-320對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響。 5.miR-375促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化及可能機(jī)制。 結(jié)果： 1.miRNAs芯片分析：誘導(dǎo)分化結(jié)束時(shí)，兩種脂肪細(xì)胞內(nèi)均含許多脂滴，90％以上的細(xì)胞能被油紅O染色；且PPARγ2和aP2

12、的基因表達(dá)顯著增加，這些結(jié)果表明3T3-L1前脂肪細(xì)胞和MSC分化成成熟的脂肪細(xì)胞。芯片結(jié)果顯示：3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞上調(diào)的miRNAs有26個(gè)，下調(diào)的miRNAs有2個(gè)：小鼠MSC分化成脂肪細(xì)胞上調(diào)的miRNAs有20個(gè)，下調(diào)的miRNAs有55個(gè)。 2.脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的miRNAs及其靶基因：應(yīng)用生物信息學(xué)方法，選擇了3個(gè)可能與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的miRNAs（miR-320，21和miR-375），且MAP

13、K1（ERK2）可能是這3個(gè)miRNAs的靶基因。 3.miRNAs對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響：油紅O染色結(jié)果表明：miR-375顯著增加脂肪細(xì)胞的OD值，而miR-21和AMO-miR-320對(duì)脂肪細(xì)胞的OD值無顯著影響，提示miR-375能促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化。 4.miR-375促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化及可能機(jī)制：RT-PCR結(jié)果表明：對(duì)照組和miR375組在分化過程中PPARγ2和aP2