MK801對(duì)Aβ25-35大鼠大腦額葉及顳葉皮層損傷的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的
　　目前，關(guān)于阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Aβ在腦組織的沉積是各種原因誘發(fā)AD的共同通路。Aβ是由其前體蛋白APP裂解而來(lái)，它可以通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸受體亞基NR2B及谷氨酸受體阻斷劑地卓西平馬來(lái)酸鹽(dizocilpinemalte，MK801)間接影響細(xì)胞的釋放功能，從而減輕AD的病理變化。星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性表達(dá)產(chǎn)物S100β過(guò)量表達(dá)可能是誘導(dǎo)神經(jīng)病

2、理學(xué)變化的重要原因，同時(shí)它與Aβ協(xié)同啟動(dòng)凋亡系統(tǒng)，而B(niǎo)ax和Bcl-2正是凋亡反應(yīng)的主要指標(biāo)。
　　近年來(lái)關(guān)于谷氨酸的離子型受體NMDA在AD發(fā)病機(jī)制中的作用備受關(guān)注，長(zhǎng)時(shí)間NMDA受體被激活，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞持續(xù)釋放Aβ，而MK801卻可以阻斷NMDA受體的離子通道，從而防止谷氨酸損傷神經(jīng)細(xì)胞。也有研究證明老年大鼠腦內(nèi)NR2B的mRNA和蛋白質(zhì)均明顯減少，而提高NR2B的含量，卻可以改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　但是，國(guó)內(nèi)外

3、關(guān)于Aβ?lián)p傷大鼠額葉及顳葉皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞活化時(shí)產(chǎn)生的S100β與Ca2+，以及Aβ與NR2B關(guān)系的研究尚少。因此，本研究擬采用體內(nèi)外研究相結(jié)合的方法，進(jìn)一步探討Aβ是否能夠通過(guò)NMDA受體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，同時(shí)對(duì)比觀察MK801對(duì)Aβ大鼠額葉及顳葉皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞與錐體細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，為AD的預(yù)防及治療提供可靠的形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及免疫學(xué)基礎(chǔ)。
　　研究方法
　　一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　?。ㄒ唬﹦?dòng)物模型制作及分

4、組
　　選用中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心在相同環(huán)境下飼養(yǎng)的SPF級(jí)Wistar雄性大鼠60只，4月齡，體重250～270g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、Aβ?lián)p傷組和MK801組，每組各20只。選擇左側(cè)側(cè)腦室為注射靶區(qū)?？瞻讓?duì)照組:不做任何處理。Aβ?lián)p傷組:注射Aβ25-35(5g/L)溶液3μL，以后每天給藥2μL，持續(xù)2周。MK801組:注射Aβ25-35(5g/L)溶液3μL，以后每天給藥2μL，持續(xù)2周。再通過(guò)微量給藥系統(tǒng)注射MK801

5、(0.03g/L)溶液，每次2μL，持續(xù)1周。
　?。ǘ㎝orris水迷宮行為學(xué)測(cè)試
　?。ㄈ┟庖呓M織化學(xué)方法
　　（四）Westernblot方法
　　二、體外實(shí)驗(yàn)
　?。ㄒ唬┬切文z質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)、鑒定及分組
　　(1)空白對(duì)照組:不做任何處理;(2)Aβ?lián)p傷組:給予原代培養(yǎng)第20天的細(xì)胞Aβ25-3510μM/L孵育24h;(3)MK801組:首先給予Aβ25-3510μM/L孵育24h，再給

6、予MK801，終濃度為10μM/L每隔24h給藥一次，共3次。
　?。ǘ┘?xì)胞活力檢測(cè)
　?。ㄈ〩oechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　（四）鈣離子熒光探針技術(shù)
　?。ㄎ澹┟庖邿晒饧夹g(shù)
　　三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS18.0，Grampadprism5，ImageJ1.5.1，Imageproplus6.0和Photoshop8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean

7、±s）表示，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01有顯著性差異。
　　結(jié)果
　　一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　?。ㄒ唬㎝orris水迷宮測(cè)試大鼠行為學(xué)變化
　　1、平均游泳速度
　　Aβ?lián)p傷組與空白對(duì)照組比較及MK801組與Aβ?lián)p傷組比較，平均游泳速度均無(wú)差異。
　　2、平均逃避潛伏期
　　Aβ?lián)p傷組與空白對(duì)照組比較逃避潛伏期延長(zhǎng)，MK801組與Aβ?lián)p傷組比較逃避潛伏期縮短。
　　3、目標(biāo)象限游泳時(shí)間百

8、分比
　　Aβ?lián)p傷組與空白對(duì)照組比較游泳時(shí)間百分比延長(zhǎng);MK801組與Aβ?lián)p傷組比較游泳時(shí)間百分比縮短。
　　4、穿越平臺(tái)次數(shù)
　　Aβ?lián)p傷組與空白對(duì)照組比較及MK801組與Aβ?lián)p傷組比較，穿越平臺(tái)次數(shù)均無(wú)差異。
　?。ǘ┟庖呓M化方法觀察額葉皮層四種蛋白的表達(dá)
　　1、S100β蛋白的表達(dá)
　　鏡下觀察空白對(duì)照組S100β陽(yáng)性細(xì)胞較少，Aβ?lián)p傷組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組明顯增多;MK801組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

9、較Aβ?lián)p傷組減少。
　　2、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)
　　鏡下觀察Aβ?lián)p傷組Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組明顯增多;各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白的表達(dá)存在明顯差異，Aβ?lián)p傷組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組明顯減少;MK801組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較Aβ?lián)p傷組增多。
　　3、NR2B蛋白的表達(dá)
　　鏡下觀察與空白對(duì)照組比較，Aβ?lián)p傷組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少;與Aβ?lián)p傷組比較MK801組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多。
　　（三）Westernblot

10、方法檢測(cè)額葉及顳葉皮層四種蛋白的表達(dá)
　　對(duì)條帶灰度進(jìn)行灰度測(cè)定和分析，結(jié)果顯示:S100β在Aβ?lián)p傷組額葉與顳葉皮層中的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯上調(diào)，與Aβ?lián)p傷組比較MK801組S100β表達(dá)下調(diào)。Bax在額葉及顳葉皮層的表達(dá)一致，與空白對(duì)照組比較，Aβ?lián)p傷組的Bax表達(dá)明顯上調(diào)，與Aβ?lián)p傷組比較，MK801組的Bax表達(dá)下調(diào)。與空白對(duì)照組比較Bcl-2在Aβ?lián)p傷組額葉皮層表達(dá)上調(diào)，與Aβ?lián)p傷組比較Bcl-2在MK801組的表達(dá)上調(diào)

11、;與空白對(duì)照組比較Bcl-2在Aβ?lián)p傷組顳葉皮層的表達(dá)下調(diào)，與Aβ?lián)p傷組比較其在MK801組的表達(dá)明顯下調(diào)。NR2B在額葉的Aβ?lián)p傷組的表達(dá)較空白對(duì)照組下調(diào)，其在MK801組顳葉皮層的表達(dá)與Aβ?lián)p傷組比較上調(diào)。
　　二、體外實(shí)驗(yàn)
　?。ㄒ唬┘?xì)胞活力檢測(cè)
　　MTT法檢測(cè)MK801對(duì)Aβ25-35所致細(xì)胞活力的變化，與空白對(duì)照比較，隨藥物濃度的加大Aβ?lián)p傷組與空白對(duì)照組比較細(xì)胞活力下降，MK801組與Aβ?lián)p傷組比較細(xì)胞活

12、力升高。
　?。ǘ〩oechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　檢測(cè)空白對(duì)照組、Aβ?lián)p傷組和MK801組細(xì)胞的凋亡，空白對(duì)照組凋亡沒(méi)有發(fā)生變化，趨勢(shì)穩(wěn)定，Aβ?lián)p傷組及MK801組細(xì)胞凋亡隨Aβ25-35濃度的增大而加重。與空白對(duì)照組比較Aβ?lián)p傷組的細(xì)胞凋亡加重，而MK801組細(xì)胞凋亡較Aβ?lián)p傷組減輕。
　?。ㄈ┾}離子熒光探針技術(shù)
　　空白對(duì)照組、Aβ?lián)p傷組和MK801組細(xì)胞隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度逐漸

13、增強(qiáng)，Aβ?lián)p傷組與空白對(duì)照組比較細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多顯著，MK801組與Aβ?lián)p傷組比較細(xì)胞內(nèi)鈣離子明顯減少。
　　（四）免疫熒光技術(shù)
　　Aβ?lián)p傷組與空白對(duì)照組比較S100β表達(dá)的紅色熒光較多;MK801組與Aβ?lián)p傷組比較S100β的表達(dá)減少。與空白對(duì)照組比較Aβ表達(dá)的綠色熒光較多;MK801組與Aβ?lián)p傷組比較Aβ的表達(dá)減少。
　　結(jié)論
　　1、Aβ25-35大鼠額葉及顳葉皮層錐體細(xì)胞Bax表達(dá)上調(diào)，顳葉Bcl-2表

14、達(dá)下調(diào)，并增加細(xì)胞凋亡。
　　2、星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠通過(guò)上調(diào)NR2B亞基的表達(dá)緩解Aβ25-35的神經(jīng)毒性。
　　3、MK801能夠明顯下調(diào)Aβ?lián)p傷大鼠Bax的表達(dá)水平，上調(diào)Bcl-2的水平;并緩解Aβ25-35所致的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化。
　　4、MK801能夠明顯下調(diào)Aβ?lián)p傷大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞S100β與上調(diào)NR2B的表達(dá)水平。
　　5、Aβ25-35致細(xì)胞活力下降與細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，而MK801卻可以緩解這一變