慢病毒載體介導胰島素樣生長因子-1基因修飾肌源性干細胞移植治療雌性壓力性尿失禁大鼠的實驗研究.pdf

1、目的：探討慢病毒載體介導的胰島素樣生長因子-1（IGF-1）基因修飾的肌源性干細胞（MDSCs）移植對雌性壓力性尿失禁大鼠模型的作用及可能機制，為細胞移植策略治療女性壓力性尿失禁提供新的理論依據(jù)。
　　方法：1、體外原代MDSCs的分離、純化、分化和鑒定。取Wistar大鼠腓腸肌，機械法和酶消化法后，采用改良差速貼壁法純化大鼠原代MDSCs，通過倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長形態(tài)和分化情況，采用流式細胞儀術、細胞免疫熒光化學、免疫細

2、胞化學對P3-MDSCs進行表型鑒定，同時對分化培養(yǎng)的P3-MDSCs進行MyHC蛋白檢測。2、采用體外重組（in-fusion）技術，以攜帶增強型綠色熒光蛋白（eGFP）的pGC-FU慢病毒載體系統(tǒng)作為基因轉導的媒介，構建攜帶IGF-1基因重組的慢病毒表達載體（pGC-FU-IGF-1），通過聚合酶鏈式反應（PCR）、酶切和測序的方式鑒定所構建的載體并轉染293T細胞，以熒光顯微鏡觀察綠色熒光，以Western blot檢測GFP蛋白

3、的表達，以實時定量熒光PCR（RT-QPCR）檢測慢病毒的滴度。將攜帶有IGF-1＆eGFP融合基因的慢病毒和僅攜帶eGFP的慢病毒感染大鼠MDSCs（分別為IGF-1/MDSCs組和GFP/MDSCs組），通過熒光表達情況以及酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）結果確定最佳感染復數(shù)（MOI）。3、取最佳MOI慢病毒感染MDSCs，待IGF-1/MDSCs組和GFP/MDSCs組達到90％融合后，模擬體內氧化應激微環(huán)境，體外建立過氧化氫（H2

4、O2）誘導細胞凋亡模型，MTS法檢測不同濃度不同時間的H2O2干預對MDSCs活性的影響，并通過流式、DNA ladder探討H2O2對MDSCs凋亡的影響；Western blot檢測MDSCs內抗凋亡相關蛋白P-AKT、NFκB、Bcl-2以及Bcl-xl與凋亡相關蛋白caspase-3、PARP的表達情況，探討IGF-1基因修飾的MDSCs抑制細胞凋亡的可能機制。4、采用雙側陰部神經(jīng)橫斷法（PNT）建立雌性壓力性尿失禁大鼠模型，6

5、0只成年雌性大鼠隨機均分為假手術組（S組）、溶劑對照組（PBS組）、空病毒感染的MDSCs移植組（GFP/MDSCs組）和IGF-1基因修飾的MDSCs移植組（IGF-1/MDSCs組），以1×106個/只細胞數(shù)注入尿道距膀胱約0.5cm處，每組再按治療后1、2、4周分為3個亞組（每組5只）。采用尿動力學評價造模成功與否，并評價注射治療1、2、4周后尿道閉合功能情況。注射治療1周后，采用激光共聚焦掃描顯微鏡評價移植細胞存活情況。注射治療

6、4周后，免疫組織化學評價近端尿道毛細血管生成情況；伊紅-蘇木素（HE）及Masson染色評價近端尿道組織病理學改變；多重免疫熒光技術評價移植細胞的分化情況。在注射治療的各個時間點，免疫組織化學和Western blot檢測胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）的表達情況。
　　結果：1、所分離培養(yǎng)的MDSCs具有低粘附性、小圓形、折光性強的生物學特性，可以形成肌管，細胞表型鑒定為Sca-l（＋）、CD

7、34（＋）、CD45（－）和desmin（＋），符合MDSCs的特征。2、所構建的IGF-1＆eGFP重組慢病毒載體，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定完全正確，轉染293T細胞后能夠正常表達，測得病毒滴度為2×108TU/ml。慢病毒感染MDSCs后，隨著MOI值的增加，熒光強度逐漸增強，并伴隨IGF-1分泌水平顯著增加（p﹤0.01）。3、低溶度（﹤200 uM）、短時間的H2O2（﹤0.5h）干預對MDSCs的活性無明顯影響（p＞0.05）

8、，隨著H2O2濃度的增加，作用時間的延長，MDSCs的活性顯著下降（p﹤0.01），其中，GFP/MDSCs組下降更為明顯（p﹤0.01）。通過DNA ladder凝膠電泳以及流式細胞儀雙染檢測分析，發(fā)現(xiàn)H2O2能夠誘導MDSCs caspase酶依賴性凋亡，而IGF-1能夠拮抗H2O2作用，上調抗凋亡相關蛋白P-AKT、NFκB、Bcl-2以及Bcl-xl的表達（p﹤0.05），降低caspase-3、PARP的水解程度（p﹤0.01

9、）。4、成功構建壓力性尿失禁大鼠模型。細胞注射治療1周后，IGF-1/MDSCs組的細胞存活率顯著高于GFP/MDSCs組（p﹤0.01），4周后，移植的細胞可以分化為MyHC，其中IGF-1/MDSCs組的細胞分化強度強于GFP/MDSCs組。IGF-1/MDSCs組和GFP/MDSCs組在細胞治療1、2、4周后無論是膀胱最大容量（MBC）還是腹壓漏尿點壓力（ALPP）均顯著高于PBS組（p﹤0.01），低于假手術組（p＞0.05），

10、其中IGF-1/MDSC組略高于GFP/MDSCs組（p＞0.05）。治療4周后，IGF-1/MDSCs組新生的毛細血管密度顯著高于GFP/MDSCs組（p﹤0.01），后者又高于PBS組及S組（p﹤0.01）。細胞治療的各個時間點，IGF-1/MDSCs組的IGF-1和VEGF蛋白表達量與各組比較顯著升高（p﹤0.01），而GFP/MDSCs組在細胞治療1、2周后，明顯高于S組及PBS組（p﹤0.01），4周后，降至正常水平（p＞0.

11、05）。組織形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)：IGF-1/ MDSCs組有較多新生血管及肌纖維形成，GFP/MDSCs組可見部分新生肌纖維和少許新生血管，PBS組可見尿道平滑肌、橫紋肌層變性、萎縮，血管減少。定量肌/膠原比率發(fā)現(xiàn)：S組﹥IGF-1/MDSCs組﹥GFP/MDSCs組﹥PBS組（p﹤0.05）。
　　結論：本研究可以從Wistar大鼠中成功分離出純度較高的MDSCs；成功構建IGF-1＆eGFP融合基因重組慢病毒表達載體，并能夠安全有