脂肪源性干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞聯(lián)合移植治療大鼠壓力性尿失禁的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1.體外分離培養(yǎng)大鼠脂肪源性干細(xì)胞（Adipose-derived stromal cells,ADSCs）和成纖維細(xì)胞；
　　2.建立壓力性尿失禁（Stress urinary incontinence,SUI）模型，觀察不同數(shù)量的異體ADSCs和成纖維細(xì)胞聯(lián)合移植于尿道中段周圍后對(duì)尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響及細(xì)胞注射后尿道及周圍組織的形態(tài)學(xué)變化，比較各組對(duì)壓力性尿失禁的治療效果。
　　方法：
　　1.采用

2、膠原酶I分離提取大鼠ADSCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀對(duì)表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定；采用改良式兩步酶消化法獲取成纖維細(xì)胞，用免疫組織化學(xué)法將其鑒定；根據(jù)不同細(xì)胞群貼壁能力的差異使用差速貼壁離心法使兩者純化；利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的增殖情況及形態(tài)學(xué)變化，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理想的細(xì)胞源。
　　2.36只SD雌性未孕大鼠隨機(jī)分為兩組：正常組6只,未造模且未行注射治療；實(shí)驗(yàn)組30只進(jìn)行陰道持續(xù)擴(kuò)張和雙側(cè)卵巢切除術(shù)，2周后所有大鼠均用BL-420生物機(jī)能檢測(cè)

3、儀測(cè)定最大膀胱容量和腹壓漏尿點(diǎn)壓力，驗(yàn)證模型均建立成功。
　　3.將造模成功后1個(gè)月的所有實(shí)驗(yàn)組大鼠又隨機(jī)分為5組（6只/組）。在顯微鏡下將40uL的細(xì)胞數(shù)量分別為1×104、1×105、1×106的ADSCs和成纖維細(xì)胞混懸液分別移植于大鼠尿道中段周圍的3點(diǎn)和9點(diǎn)處，而生理鹽水作為對(duì)照組，并設(shè)立空白組，術(shù)后1個(gè)月進(jìn)行尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，評(píng)估對(duì)壓力性尿失禁的治療效果。
　　4.細(xì)胞移植1個(gè)月后處死大鼠，將尿道及陰道前壁組織進(jìn)行

4、取材，采用HE染色評(píng)價(jià)細(xì)胞移植后尿道周圍組織病理變化。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用(x)±s表示。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊時(shí)，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；不滿足則采用秩和檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1.體外培養(yǎng)的ADSCs呈多角形或梭形的漩渦狀細(xì)胞集落，形態(tài)均一，細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44，不表達(dá)CD45，陽(yáng)

5、性率分別為96.63％、78.53%和0.75%。體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞與ADSCs形態(tài)相似，經(jīng)免疫組化鑒定，波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性，定位于胞質(zhì)，而角蛋白表達(dá)陰性。經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察，大鼠ADSCs和成纖維細(xì)胞經(jīng)第三次傳代后，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，仍保持較強(qiáng)的分裂增殖活力。
　　2.陰道持續(xù)擴(kuò)張加雙側(cè)卵巢切除能夠成功建立SUI動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)組與正常組的最大膀胱容量（ml）分別為1.83±0.54、3.08±0.28，腹壓漏尿點(diǎn)壓力（cmH

6、2O）為76.02±2.56、24.91±2.94，實(shí)驗(yàn)組較正常組明顯降低（P＜0.001）。
　　3.將不同數(shù)量的ADSCs和成纖維細(xì)胞聯(lián)合移植1個(gè)月后，經(jīng)尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，正常組、SUI組、生理鹽水組、1×104組、1×105組、1×106組最大膀胱容量（ml）分別為3.08±0.28、1.89±0.36、1.93±0.60、2.10±0.55、2.23±0.66和2.54±0.38，組間比較示：正常組與其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P

7、＜0.001），1×106組與SUI組、生理鹽水組比較有差異，其余各組間比較均無(wú)差異（P＞0.05）；各組腹壓漏尿點(diǎn)壓力（cmH2O）分別為76.02±2.56、26.26±3.01、29.17±4.09、32.96±4.99、36.82±4.22和41.16±3.57，組間比較示：正常組與其余各組均有差異（P＜0.001），但SUI組與生理鹽水組無(wú)差異（P＞0.05），1×104組與SUI組有差異，1×105組與SUI組、生理鹽水組有

8、差異，1×106組與SUI組、生理鹽水組和1×104組均有差異（P＜0.001）。
　　4.不同數(shù)量的ADSCs和成纖維細(xì)胞聯(lián)合移植后各組尿道及周圍組織的形態(tài)學(xué)變化：正常組尿道有完整的肌層結(jié)構(gòu)，肌纖維呈束狀緊密排列。SUI組尿道肌層受損，排列紊亂并變薄，且肌纖維之間出現(xiàn)松散、斷裂及萎縮現(xiàn)象。而生理鹽水組無(wú)明顯變化，但尿道形成瘢痕及纖維化。細(xì)胞移植組，移植局部尿道肌層明顯增厚（P＜0.01），肌纖維排列仍相對(duì)松散和紊亂，周圍結(jié)締組織

9、變緊密，但是細(xì)胞各數(shù)量級(jí)間未見明顯差異(P＞0.05)。正常組陰道前壁可見清晰的粘膜層、肌層和外膜層結(jié)構(gòu)，平滑肌束粗大，呈編織狀，膠原含量豐富、致密。SUI組肌層較薄，面積變小，肌纖維之間失去正常的連接結(jié)構(gòu)，肌束間隙增寬，膠原纖維散在分布且出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。生理鹽水組和細(xì)胞移植組均未見明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)差速貼壁法和膠原酶消化法可獲得純度較高、生物活性較好的脂肪源性干細(xì)胞；采用差速貼壁結(jié)合改良式兩