AtSARK與SSPP互作調(diào)控葉片衰老機(jī)制的研究及大豆GmATG8c的功能驗(yàn)證.pdf

1、葉片衰老是受遺傳程序嚴(yán)格控制的發(fā)育過(guò)程，由特殊發(fā)育信號(hào)通過(guò)一定的信號(hào)傳導(dǎo)路徑來(lái)啟動(dòng)和控制。分離、鑒定參與啟動(dòng)和調(diào)控葉片衰老過(guò)程的關(guān)鍵基因，并對(duì)其功能進(jìn)行深入的分子生物學(xué)分析，是揭示植物葉片衰老分子機(jī)制的重要課題。在葉片衰老過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從衰老葉片向新生的組織器官發(fā)生轉(zhuǎn)移。細(xì)胞自噬作為葉片衰老過(guò)程中的重要事件，參與到葉片衰老過(guò)程中氮(N)素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的再動(dòng)員，對(duì)自噬的研究也有助于理解葉片衰老過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。
　　本文的研

2、究?jī)?nèi)容分為兩部分。
　　第一部分主要是對(duì)AtSARK與SSPP互作調(diào)控葉片衰老分子機(jī)制的研究。我們實(shí)驗(yàn)室的前期工作發(fā)現(xiàn)，大豆LRR型類受體蛋白激酶基因GmSARK以及它在擬南芥中的同功能基因:另一個(gè)LRR型類受體蛋白激酶基因AtSARK，具有正向調(diào)控葉片衰老的功能，它們通過(guò)生長(zhǎng)素和乙烯的協(xié)同作用參與植物葉片衰老的正調(diào)控過(guò)程，并且GmSARK和AtSARK都是絲/蘇氨酸和酪氨酸雙底物特異性蛋白激酶。此外，實(shí)驗(yàn)室前期還分離鑒定了一個(gè)參

3、與葉片衰老負(fù)調(diào)控過(guò)程的蛋白磷酸酶編碼基因，SSPP。SSPP的轉(zhuǎn)錄水平受到自然衰老和SARK誘導(dǎo)的衰老的抑制，并且過(guò)表達(dá)SSPP轉(zhuǎn)基因擬南芥具有衰老延緩的表型。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)SSPP的生化特點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，SSPP編碼一個(gè)依賴于鎂離子的PP2C型蛋白磷酸酶。我們發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過(guò)表達(dá)SSPP不僅能延緩擬南芥的自然衰老，還能延緩黑暗誘導(dǎo)的葉片衰老表型，并且發(fā)現(xiàn)SSPP過(guò)表達(dá)能引起黃化苗乙烯釋放量的減少以及對(duì)ACC處理敏感性的下降。我們將S

4、SPP在GVG:AtSARK的背景下過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AtSARK誘導(dǎo)的早衰現(xiàn)象消失，并且AtSARK誘導(dǎo)的衰老相關(guān)標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)現(xiàn)象在G VG:AtSARK/35S:SSPP雙轉(zhuǎn)基因材料中也被抑制，說(shuō)明SSPP能抑制AtSARK在葉片衰老中的功能。進(jìn)一步的體外磷酸化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SSPP能以AtSARK-CD為底物，對(duì)發(fā)生了自磷酸化的AtSARK-CD進(jìn)行脫磷酸化作用，而AtSARK-CD則不能以SSPP為底物。Pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

5、SSPP能與AtSARK-CD發(fā)生直接的相互作用，并且通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)證明，SSPP與AtSARK能在植物細(xì)胞的質(zhì)膜上發(fā)生互作。這些結(jié)果暗示SSPP可能通過(guò)對(duì)AtSARK磷酸化狀態(tài)的控制發(fā)揮其對(duì)葉片衰老負(fù)調(diào)控的功能。此外，本研究發(fā)現(xiàn)SSPP還能與大豆GmSARK的激酶域（GmSARK-KD）發(fā)生互作，暗示著PP2C型蛋白磷酸酶SSPP與LRR型類受體蛋白激酶SARKs的這種調(diào)控關(guān)系在高等植物中是一種普遍機(jī)制。我們的這些

6、結(jié)果表明SSPP通過(guò)與AtSARK發(fā)生互作，負(fù)向調(diào)控葉片衰老的起始和進(jìn)程。
　　在此基礎(chǔ)上，為了深入研究AtSARK與SSPP互作調(diào)控葉片衰老的具體機(jī)制，發(fā)掘AtSARK上被SSPP攻擊的磷酸化位點(diǎn)，我們首先對(duì)AtSARK關(guān)鍵的自磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了分析鑒定。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，AtSARK胞內(nèi)域（AtSARK-CD）在自磷酸化發(fā)生后，有27個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了磷酸化，其中有2個(gè)位于近膜域，15個(gè)位于激酶域，還有10個(gè)位于CT域。對(duì)所有27個(gè)

7、位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，用丙氨酸(A)或苯丙氨酸(F)模擬該位點(diǎn)的非磷酸化狀態(tài)，用天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)模擬突變位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)，并對(duì)影響AtSARK-CD自磷酸化的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)了影響AtSARK自磷酸化的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　基于對(duì)AtSARK-CD磷酸化位點(diǎn)的分析，我們對(duì)SSPP與AtSARK互作的具體機(jī)制進(jìn)行了初步的探索。用pull-down的方法對(duì)一些自磷酸化位點(diǎn)的點(diǎn)突變對(duì)AtSARK-CD與SSPP的互作影響進(jìn)行了

8、分析。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變具有影響互作的功能:AtSARK-CDT189D所模擬的組成型的磷酸化狀態(tài)影響了SSPP與AtSARK的相互作用，這個(gè)結(jié)果暗示了在葉片衰老過(guò)程中，可能存在某種通過(guò)對(duì)SARK結(jié)構(gòu)或者磷酸化狀態(tài)的改變來(lái)解除SSPP對(duì)SARK抑制作用的分子機(jī)制;AtSARK-CDS369A影響互作而AtSARK-CDS369D不影響互作的結(jié)果暗示S369是重要的AtSARK上與SSPP發(fā)生互作的位點(diǎn)，發(fā)生在CT域上S369的磷酸化能

9、為SSPP提供錨定位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)T189位點(diǎn)的生物學(xué)功能進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)影響與SSPP互作的點(diǎn)突變則會(huì)保持AtSARK的功能，說(shuō)明AtSARK的功能與SSPP的互作有關(guān)。
　　最后，為了進(jìn)一步研究AtSARK和SSPP調(diào)控葉片衰老的分子機(jī)制，我們分別對(duì)AtSARK和SSPP的其他互作組分進(jìn)行了篩選。首次用酵母雙雜交的方法篩選了AtSARK-CD在擬南芥cDNA文庫(kù)中的互作組分，獲得83個(gè)候選組分，它們大部分為參與各種代謝

10、過(guò)程的酶，參與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的蛋白以及參與信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白。我們對(duì)其中的一個(gè)表達(dá)受到衰老抑制的、推測(cè)為醛縮酶的候選組分FBAL與AtSARK-CD的互作進(jìn)行了驗(yàn)證。另一方面，我們以SSPP為誘餌蛋白通過(guò)酵母雙雜交的方法篩選了SSPP的互作組分，獲得19個(gè)候選組分，其0000中大部分屬于生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白家族成員。令人感興趣的是，我們篩選到了一個(gè)推測(cè)為Ring型的E3連接酶組分同時(shí)出現(xiàn)在AtSARK和SSPP的候選互作組分中，命名為KPIL(

11、Kinase and Phosphatase co-Interacted E3 Ligase)，我們通過(guò)BiFC實(shí)驗(yàn)證明KPIL能分別與AtSARK和SSPP在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生互作。
　　本文的第二部分對(duì)大豆自噬基因GmATG8c的生化功能和生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。細(xì)胞自噬是一種進(jìn)化上保守的多功能真核生物細(xì)胞器降解機(jī)制，能被多種生理脅迫狀態(tài)所誘導(dǎo)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞組分的降解，實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的回收利用。前期研究發(fā)現(xiàn)影響植物自噬的突變體表現(xiàn)為種子

12、產(chǎn)量下降而促進(jìn)自噬的過(guò)表達(dá)材料表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)促進(jìn)。由于酵母ATG8具有介導(dǎo)自噬體形成的功能，是處于自噬進(jìn)程中心位置的重要蛋白，我們推測(cè)作物中ScATG8的同源基因可能具有NUE潛力。通過(guò)序列分析，我們發(fā)現(xiàn)大豆基因組中有11個(gè)編碼ATG8的同源基因?；趯?shí)驗(yàn)室前期對(duì)大豆ATG8s在缺氮條件下的轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果，我們選擇GmATG8c進(jìn)行功能驗(yàn)證分析。用免疫印跡分析的方法對(duì)APE1的裝配進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在回補(bǔ)菌株中，在正常和氮饑餓條件下的AP

13、E1裝配都得到了部分的恢復(fù)，表明GmATG8c具有酵母ScATG8的功能;此外，在正常和缺氮條件下，GmATG8c的過(guò)表達(dá)擬南芥中的MDC染色小體（推測(cè)為自噬小體）數(shù)量都顯著增加，暗示過(guò)表達(dá)GmATG8c能增強(qiáng)植物的自噬。并且過(guò)表達(dá)GmATG8c的轉(zhuǎn)基因大豆愈傷組織表現(xiàn)出促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)，增強(qiáng)愈傷組織低氮脅迫耐受性的表型。
　　綜上所述，本課題首次研究了擬南芥葉片衰老相關(guān)的蛋白磷酸酶SSPP調(diào)控葉片衰老的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在葉片衰老調(diào)