白念珠菌形態(tài)、胞壁多糖的結(jié)構(gòu)及其免疫學(xué)活性的相關(guān)研究.pdf

1、目的：①探討單個(gè)氨基酸對(duì)白念珠菌菌絲形成的影響。②探討不同pH值和氧氣對(duì)白念珠菌菌絲形成的影響。③探討電子傳遞鏈對(duì)白念珠菌菌絲形成的影響。④探討溫度和二氧化碳對(duì)白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的影響及其致病性差異。⑤分離純化白念珠菌菌絲相和酵母相細(xì)胞壁甘露聚糖并進(jìn)行物化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析。⑥分離純化白念珠菌菌絲相和酵母相細(xì)胞壁不溶性葡聚糖并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。⑦探討真菌胞壁多糖誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞THP—1免疫應(yīng)答機(jī)制。 方法：⑴用0.67％的酵母氮源基礎(chǔ)培

2、養(yǎng)基和2％葡萄糖配制成SD合成培養(yǎng)基，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，研究單個(gè)天然氨基酸對(duì)白念珠菌形態(tài)學(xué)的影響，并分別通過不添加碳源和厭氧條件下培養(yǎng)觀察對(duì)精氨酸誘導(dǎo)的菌絲形成的影響。⑵通過調(diào)節(jié)Muller—Hinton液體培養(yǎng)基的pH值和去除培養(yǎng)基中的氧氣來觀察白念珠菌的生長曲線，倍增時(shí)間和菌絲形成率的變化。⑶用含10％小牛血清的RPMI1640在5％CO237℃培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)白念珠菌菌絲形成，通過加用電子傳遞鏈的抑制劑和激動(dòng)劑，觀察白念珠菌菌絲形

3、成的影響、生長曲線和菌絲形成率。MTT法檢測(cè)對(duì)白念珠菌的抑制率。⑷通過調(diào)整溫度和二氧化碳的濃度觀察白念珠菌在含熒光桃紅B的改良Lee培養(yǎng)基上WO形態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)換，并通過與單核巨噬細(xì)胞THP—1共培養(yǎng)，觀察單核巨噬細(xì)胞THP—1胞內(nèi)和胞外殺傷白念珠菌WO兩種形態(tài)的差異。⑸通過37℃恒溫RPMI1640培養(yǎng)體外獲得白念珠菌菌絲相，通過37℃恒溫SDB培養(yǎng)體外獲得白念珠菌酵母相。稀堿法提取粗多糖，透析和過陰離子交換柱層析純化，改良苯酚硫酸法

4、收集洗脫液，合并主糖峰管。高效凝膠過濾色譜、糖組成分析、甲基化分析和核磁共振進(jìn)行物化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析。⑹通過37℃恒溫RPMI1640培養(yǎng)體外獲得白念珠菌菌絲相，通過37℃恒溫SDB培養(yǎng)體外獲得白念珠菌酵母相。采用氫氧化鈉、鹽酸和乙醇提取白念珠菌的細(xì)胞壁不溶性葡聚糖，硫酸化后變成可溶性葡聚糖，同時(shí)進(jìn)行單糖組成分析、甲基化分析以及核磁共振進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。⑺通過RT-PCR檢測(cè)Dectin—1和TNF-α mRNA的表達(dá)，ELISA和流式細(xì)胞儀

5、檢測(cè)細(xì)胞分泌TNF-α和細(xì)胞膜Dectin—1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：①在含10mmol/L的L—精氨酸的SD液體培養(yǎng)基中，可見大量的菌絲。在含10mmol/L的L—半胱氨酸、L—蘇氨酸、L—纈氨酸和L—色氨酸的SD液體培養(yǎng)基中，可見典型的酵母細(xì)胞，未見菌絲。②在無氧氣的液體培養(yǎng)基中，白念珠菌生長緩慢，不能產(chǎn)生菌絲，只有酵母細(xì)胞形成。生長曲線的延緩期內(nèi)各組沒有明顯差異，而在生長的對(duì)數(shù)期pH3和pH4的條件下念珠菌生長速度明顯慢于pH

6、5、pH6、pH7、pH8和pH9。菌絲形成率在pH3、pH4和pH5條件下不到20％，而在pH6、pH7、pH8和pH9條件下可高達(dá)70％。③氯仿和二甲基亞砜的溶媒對(duì)照與空白對(duì)照之間對(duì)白念珠菌的生長和菌絲形成的影響無差異。噻吩甲酰三氟丙酮(TTFA)和苯甲羥肟酸作用于白念珠菌24h后細(xì)胞形態(tài)以酵母為主。④在0.03％CO225℃、0.03％CO237℃和5％CO237℃三種培養(yǎng)條件下，白念珠菌W→O轉(zhuǎn)換的O菌落占總菌落數(shù)的比例分別為0

7、.572±0.087、0.920±0.030和0.985±0.026(P<0.05)。在0.03％CO225℃、0.03％CO237℃和5％CO237℃三種培養(yǎng)條件下，白念珠菌O→W轉(zhuǎn)換的O菌落占總菌落數(shù)的比例分別為0.60±0.114、0.983±0.003和0.998±0.003(P<0.05)。⑤從菌絲相和酵母相白念珠菌細(xì)胞壁各獲得一個(gè)甘露聚糖純品，高效凝膠過濾色譜上呈對(duì)稱性單峰，分子量分別為23KD和30KD。甲基化分析顯示這二

8、者均具有位于非還原末端甘露糖和1，2—，1，3—，1，2，6—連接的甘露糖基。核磁共振顯示以α—構(gòu)型為主，存在β—構(gòu)型的甘露糖基。⑥從菌絲相和酵母相白念珠菌細(xì)胞壁各獲得一個(gè)不溶性葡聚糖純品。甲基化分析顯示僅有1，3—連接的葡聚糖。核磁共振顯示為β—構(gòu)型的葡聚糖。⑦ Zymosan可以誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞THP—1的Dectin—1和TNF-α mRNA的表達(dá)，滅活菌絲相、滅活酵母相、Zymosan、菌絲相甘露聚糖、酵母相甘露聚糖和不溶性葡聚

9、糖均能誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞THP—1分泌TNF-α，均呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。滅活菌絲相、滅活酵母相、Zymosan和不溶性葡聚糖均能誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞THP—1的Dectin—1蛋白表達(dá)，呈時(shí)間依賴性，加用Laminarin后Dectin—1蛋白表達(dá)減弱。 結(jié)論：⑴精氨酸可以誘導(dǎo)白念珠菌菌絲形成，厭氧條件下精氨酸不能誘導(dǎo)白念珠菌菌絲形成。⑵厭氧條件抑制白念珠菌的菌絲形成。白念珠菌在pH3～9的范圍內(nèi)均能生長，偏酸性環(huán)境有利于白念珠

10、菌酵母形成，偏堿性的環(huán)境有助于菌絲的形成。⑶經(jīng)典呼吸鏈和替代途徑電子傳遞鏈的抑制劑能不同程度抑制白念珠菌的菌絲形成，替代氧化途徑是白念珠菌菌絲形成的主要途徑，可能與白念珠菌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激壓力有關(guān)。⑷白念珠菌W向O轉(zhuǎn)換的過程中，37℃有利于WO轉(zhuǎn)換，而且5％的CO2濃度能更進(jìn)一步促進(jìn)白念珠菌的WO轉(zhuǎn)換。白念珠菌O向W轉(zhuǎn)換的過程中，37℃有利于維持白念珠菌的O狀態(tài)，而且5％的CO2濃度能更進(jìn)一步維持白念珠菌的O狀態(tài)。單核巨噬細(xì)胞對(duì)O相白念珠

11、菌的殺傷效應(yīng)明顯強(qiáng)于W相白念珠菌。⑸菌絲相和酵母相的甘露聚糖結(jié)構(gòu)為以1，6—連接的甘露聚糖為主鏈，在2—O上有1，2—連接和1，3—連接甘露糖構(gòu)成的支鏈，酵母相甘露聚糖1，2—連接的甘露糖支鏈更長。⑹白念珠菌菌絲相和酵母相的不溶性葡聚糖連接結(jié)構(gòu)均為β，1—3連接的葡聚糖，二者在葡聚糖的組成、連接鍵方式和構(gòu)型方面一致。⑺滅活白念珠菌酵母相比滅活白念珠菌菌絲相能更強(qiáng)地誘導(dǎo)THP—1分泌TNF-α。白念珠菌酵母相胞壁甘露聚糖比菌絲相胞壁甘露聚