四環(huán)素調(diào)控的干擾TLR4受體的慢病毒抑制坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠的傷害性刺激的研究.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛,由外周神經(jīng),背根神經(jīng)節(jié),脊髓或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷引起,其特征是痛覺過敏、異常性疼痛及自發(fā)性疼痛。神經(jīng)病理性疼痛的治療依舊是個(gè)難題目前,臨床主要用阿片類止痛藥物治療,但其效果有限且副作用較多,這對(duì)患者的生活帶來了很大的困擾。外周神經(jīng)損傷以后,脊髓背角神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮了重要作用。Toll樣受體4(TLR4)是一種模式識(shí)別受體,參與了膠質(zhì)細(xì)胞的激活,是使中樞敏化導(dǎo)致疼痛的一個(gè)重要蛋白。然而,

2、目前尚未有針對(duì)TLR4蛋白的可利用的抑制劑。RNA干擾技術(shù)為基因功能的研究提供了可靠的途徑。由慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)已被批準(zhǔn)用于人類研究。長期的基因下調(diào)可以通過利用慢病毒攜帶小發(fā)夾RNA(shRNA)導(dǎo)入受感染細(xì)胞來實(shí)現(xiàn), shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可被細(xì)胞機(jī)制切割成 siRNA,然后siRNA結(jié)合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物上(RNA-induced silencing complex,RISC),該復(fù)合物能夠結(jié)合到目的mRNAs并將其降解。

3、
　　在本研究中我們構(gòu)建攜帶TLR4小發(fā)夾RNA的慢病毒,經(jīng)鞘內(nèi)注射進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔,擬達(dá)到治療大鼠神經(jīng)病理性疼痛的目的。為了防止慢病毒對(duì)體內(nèi)TLR4蛋白的過度抑制而產(chǎn)生副作用,我們對(duì)慢病毒加入了四環(huán)素tet-on調(diào)控系統(tǒng)。用四環(huán)素類似物強(qiáng)力霉素來啟動(dòng)慢病毒的表達(dá)。
　　大鼠的神經(jīng)病理性疼痛模型由結(jié)扎右側(cè)坐骨神經(jīng)(CCI)來構(gòu)建。慢病毒是通過鞘內(nèi)置管給予,強(qiáng)力霉素溶于動(dòng)物飲用水中通過口服的方式給予。該研究分為兩個(gè)部分:

4、　　1.四環(huán)素可調(diào)控的干擾TLR4蛋白的慢病毒包裝與構(gòu)建。
　　2.鞘內(nèi)注射慢病毒LvOn-siTLR4對(duì)坐骨神經(jīng)結(jié)扎的大鼠熱痛閾和機(jī)械痛閾的影響,此部分實(shí)驗(yàn)將SD雄性大鼠分為6組,每組7只。分別為:sham組(假手術(shù)大鼠鞘內(nèi)注射生理鹽水);CCI組(CCI大鼠鞘內(nèi)注射生理鹽水);CCI+LvOn-siTLR4+DOX組(CCI+鞘內(nèi)注射LvOn-siTLR4+口服強(qiáng)力霉素);CCI+LvOn-siTLR4組(CCI+鞘內(nèi)注射Lv

5、On-siTLR4)CCI+Lv-mismatch siRNA(CCI+攜帶錯(cuò)配序列的慢病毒);CCI+DOX組(CCI+鞘內(nèi)注射生理鹽水+口服強(qiáng)力霉素)。坐骨神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)和鞘內(nèi)注射慢病毒在一次麻醉中先后實(shí)施。通過測(cè)量大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾來評(píng)估慢病毒對(duì)大鼠疼痛的影響。術(shù)后第7天處死大鼠取脊髓腰膨大節(jié)段,分別用RT-PCR技術(shù)及western-blot分析TLR4mRNA的表達(dá)及蛋白表達(dá)的情況。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　

6、1.四環(huán)素可調(diào)控的攜帶TLR4shRNA的慢病毒成功構(gòu)建并完成滴度測(cè)定,體外轉(zhuǎn)染成功。
　　2.①與假手術(shù)組相比,CCI組的大鼠機(jī)械刺激痛和熱刺激痛閾值明顯降低(P<0.05),脊髓腰L4-L6節(jié)段TLR4的mRNA及蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。②在坐骨神經(jīng)結(jié)扎后的第3,5,7天,LvOn-siTLR4+DOX組的大鼠機(jī)械痛閾與熱痛閾值比CCI組、Lv-mismatch siRNA組及CCI+DOX組相比有明顯的升高(P<0.0

7、5),脊髓腰膨大TLR4 mRNA及蛋白的表達(dá)降低。③ CCI組與CCI+DOX組相比,大鼠機(jī)械痛閾值與熱刺激痛閾值無明顯差異(P>0.05),脊髓腰膨大TLR4 mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05).
　　結(jié)論:
　　1.四環(huán)素可調(diào)控的攜帶TLR4小干擾RNA的慢病毒成功構(gòu)建。
　　2.在CCI大鼠鞘內(nèi)注射可調(diào)控的干擾TLR4受體的慢病毒可以緩解大鼠的神經(jīng)病理性疼痛,大鼠服用強(qiáng)力霉素后熱痛閾和機(jī)械痛閾升高