促紅細(xì)胞生成素通過(guò)抑制GSK3β介導(dǎo)的Bax線粒體轉(zhuǎn)位減少6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡.pdf

1、本文分為以下兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及其可能機(jī)制
　　目的：采用6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷建立帕金森病的體外模型，探討GSK3β在6-OHDA誘導(dǎo)的凋亡途徑中的具體作用及6-OHDA對(duì)PC12凋亡的可能作用機(jī)制。
　　方法：采用6-羥基多巴胺誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷建立帕金森病的體外模型，通過(guò)MTT檢測(cè)以

2、及臺(tái)盼藍(lán)染料排除試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的6-OHDA處理后的PC12細(xì)胞活性和生存率。利用免疫印跡法測(cè)定:1、總GSK3β和p-GSK3β水平;2、Bax和β-肌動(dòng)蛋白水平，β-肌動(dòng)蛋白用作細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白的內(nèi)參對(duì)照;3、Bax和prohibition蛋白水平，prohibition蛋白用作線粒體內(nèi)蛋白的內(nèi)參對(duì)照。
　　結(jié)果：1、6-OHDA刺激24后呈劑量依賴性(10、20、50、100、200μm)地抑制PC12細(xì)胞的細(xì)胞活性及細(xì)胞存活

3、率。6-OHDA在100μM時(shí)顯著抑制PC12的活性和存活率。
　　2、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，6-OHDA處理呈時(shí)間依賴性地減少了GSK3β磷酸化。通過(guò)提取細(xì)胞線粒體和細(xì)胞質(zhì)來(lái)檢查Bax在細(xì)胞線粒體中存在的情況，結(jié)果顯示6-OHDA處理后細(xì)胞質(zhì)中Bax含量減少了，線粒體中Bax含量增加了，提示6-OHDA誘發(fā)了Bax的線粒體轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論：6-OHDA顯著降低了PC12細(xì)胞的活性，促進(jìn)了PC12細(xì)胞凋亡，G

4、SK3β在6-OHDA誘導(dǎo)的凋亡中起到一定作用，6-OHDA處理呈時(shí)間依賴性地減少GSK3β磷酸化，誘發(fā)了Bax的線粒體轉(zhuǎn)位，Bax可從細(xì)胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體中，引起線粒體功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 促紅細(xì)胞生成素(EPO)對(duì)6-羥基多巴胺誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制
　　目的：通過(guò)研究促紅細(xì)胞生成素對(duì)6-OHDA處理的PC12細(xì)胞的糖原合成酶激酶3β的磷酸化、Bax的線粒體轉(zhuǎn)位、Bcl-2表達(dá)水平、

5、半胱天冬酶3活性，探討促紅細(xì)胞生成素(EPO)抑制6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的凋亡的機(jī)制。
　　方法：PC12細(xì)胞用TDZD-8(25μM)或用不同濃度的EPO(0-10U/mL)預(yù)處理，隨后用100μM6-OHDA孵育。采用MTT檢測(cè)和臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)測(cè)定不同處理后的細(xì)胞活性;免疫印跡法觀察GSK3β磷酸化水平、總GSK3β水平、Bax在細(xì)胞內(nèi)分布情況、抗增殖蛋白水平、Bcl-2以及β-肌動(dòng)蛋白水平;Hoechst3325

6、8染色法來(lái)估算凋亡PC12細(xì)胞的比例，使用半胱天冬酶3比色測(cè)定試劑盒系統(tǒng)估算半胱天冬酶3活性。
　　結(jié)果：1、EPO呈濃度依賴性地（濃度從1至10U/mL不等）降低6-OHDA誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制，GSK3β抑制劑4-苯基-2-甲基-1，2，4-噻二唑—3，5-二酮(TDZD8)顯著逆轉(zhuǎn)6-OHDA誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制。
　　2、EPO和TDZD-8顯著逆轉(zhuǎn)6-OHDA對(duì)GSK3β磷酸化的抑制，也顯著抑制6-OHDA誘導(dǎo)的Bax線粒體轉(zhuǎn)

7、位。
　　3、6-OHDA不改變細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Bcl-2表達(dá)水平，而EPO和TDZD-8兩者也不影響B(tài)cl-2的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)水平。但6-OHDA顯著降低了Bcl-2的線粒體內(nèi)表達(dá)水平，而加入EPO和TDZD-8后可逆轉(zhuǎn)6-OHDA誘導(dǎo)的Bcl-2的線粒體內(nèi)表達(dá)降低。
　　4、EPO和TDZD-8抑制6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，6-OHDA顯著增加半胱天冬酶3活性，而EPO和TDZD則顯著抑制半胱天冬酶3活性升高。
　　結(jié)論