瞬時(shí)感受器電位離子通道4在大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓后異位放電中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 下腰痛是現(xiàn)代社會一個(gè)困擾人類健康的重要問題，它不僅給患者的工作和生活帶來極大的痛苦，而且對社會生產(chǎn)力發(fā)展也造成了嚴(yán)重的負(fù)影響。背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)作為感覺傳入的初級神經(jīng)元，在下腰痛的發(fā)病過程中起重要作用。各種損傷因素導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓(chroniccompressionofdorsalrootganglion，CCD)產(chǎn)生的根性神經(jīng)痛是下腰痛最常見的致病原因。CCD可

2、以明顯提高受損DRG神經(jīng)元的興奮性，進(jìn)而產(chǎn)生自發(fā)性疼痛、機(jī)械性的異常疼痛和熱痛覺過敏，而且伴隨著神經(jīng)元的自發(fā)性放電增加，動作電位和電流閾值降低。受壓的DRG神經(jīng)元成為異位放電的來源，即使無交感神經(jīng)活動或者內(nèi)源性化學(xué)激活物質(zhì)，仍存在自發(fā)性放電。
　　 DRG神經(jīng)元上存在多種可能參與機(jī)械刺激傳導(dǎo)的離子通道，其中在DRG上廣泛分布且高表達(dá)的TRPV4(transientreceptorpotentialvanilloidrecepto

3、r4)離子通道是一種多覺感受器，參與了滲透壓和傷害性機(jī)械刺激信號的傳導(dǎo)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CCD可以明顯上調(diào)受損DRG神經(jīng)元上TRPV4基因和蛋白的表達(dá)，而且證實(shí)TRPV4參與CCD導(dǎo)致的機(jī)械痛閾和熱痛閾。另有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV4對鈣離子和鈉離子都有通透性，TRPV4受體激活后引起細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鈣離子濃度的增加，異位放電增加。
　　 綜合以上研究我們推測，TRPV4可能與受損DRG神經(jīng)元的異位放電有關(guān)。制備CCD模型，觀察D

4、RG神經(jīng)元的持續(xù)受壓對大鼠行為學(xué)的影響，以及隨著壓迫時(shí)間的變化受損DRG神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)的改變;采用在體神經(jīng)纖維電生理技術(shù)觀察CCD后受損DRG神經(jīng)元異位放電情況及釕紅(rutheniumred，RR)和佛波醇(4α-PDD)對異位放電的影響，明確TRPV4是否參與了CCD后受損DRG神經(jīng)元的異位放電。
　　 研究目的：
　　 利用在體神經(jīng)纖維電生理技術(shù)記錄DRG神經(jīng)元持續(xù)受壓后的異位放電情況，明確TRPV4是否參與了C

5、CD后受損DRG神經(jīng)元的異位放電。
　　 研究方法：
　　 1.異位放電的記錄
　　 1.1.CCD模型的制備
　　 采用45只成年健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為正常組(n=5)、CCD組(n=10)、釕紅組(n=10)、佛波醇組(n=20)。CCD組是在大鼠麻醉后，將“U”形鋼棒的一端沿L5椎間孔的前壁上方水平插入椎管內(nèi)，使之?dāng)D壓L5DRG。正常組不進(jìn)行任何操作。
　　 1.2.術(shù)后3-8天

6、，利用在體神經(jīng)纖維電生理技術(shù)分別記錄大鼠正常組DRG及CCD組、釕紅（RR）組、佛波醇(4α-PDD)組受損DRG神經(jīng)元的異位放電情況。
　　 2.神經(jīng)行為學(xué)的測量及DRG神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察
　　 2.1.CCD模型的制備
　　 健康雄性Wistar大鼠35只，隨機(jī)分為空白對照組、手術(shù)7天組、手術(shù)14天組、手術(shù)28天組、假手術(shù)7天組、假手術(shù)14天組、假手術(shù)28天組，每組5只。手術(shù)組是在大鼠麻醉后，將“U”形鋼棒的一

7、端沿L4及L5椎間孔的前壁上方水平插入椎管內(nèi)，使之?dāng)D壓L4和L5DRG神經(jīng)元。假手術(shù)組除不插鋼棒壓迫神經(jīng)節(jié)外，其余操作同手術(shù)組，空白對照組不進(jìn)行任何操作。分別于術(shù)后7天，14天和28天處死動物。
　　 2.2.神經(jīng)行為學(xué)的測量分別于術(shù)前1天及術(shù)后不同時(shí)期（2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天及28天）測量
　　 2.2.1.動物運(yùn)動功能(motorfunction

8、)觀察動物自然狀態(tài)下隨意行走的步態(tài)，采用記分制:1分=正常步態(tài)、足無畸形;2分=正常步態(tài)伴明顯足畸形;3分=輕度步態(tài)障礙伴足下垂;4分=嚴(yán)重步態(tài)障礙伴肌無力。
　　 2.2.2.機(jī)械刺痛閾值(Mechanicalwithdrawalthreshold，MWT)和熱輻射刺激縮爪反應(yīng)潛伏期(Thermalwithdrawallatency，TWL)的測量
　　 MWT的測量使用VonFreyMonofilaments機(jī)械痛刺

9、激儀(BME-403型)。將大鼠放進(jìn)鋪有金屬網(wǎng)格的透明玻璃箱里，使用各種強(qiáng)度的VonFrey針絲，由低到高刺激動物手術(shù)側(cè)足底，縮爪或舔足為陽性反應(yīng)。每根針絲測量5次，至少能夠引發(fā)3次縮爪反應(yīng)的針絲強(qiáng)度即為機(jī)械痛閾值。
　　 TWL的測量使用熱痛刺激儀(BME—410A型)，將大鼠放進(jìn)鋪有6mm厚的有機(jī)玻璃板的透明玻璃箱里，將熱痛刺激儀放在有機(jī)玻璃板下方，使光源焦距照射動物后肢足底掌心，電子秒表記錄從照射開始到引起后肢回縮反應(yīng)時(shí)的

10、潛伏期作為熱痛覺觀測指標(biāo)。
　　 2.3.DRG神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)觀察
　　 造模后7天、14天、28天取材，HE染色，光鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)的組織形態(tài)學(xué)改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.CCD組可以記錄到受損DRG神經(jīng)元的異位放電，放電率約為67％，而正常組DRG神經(jīng)元的異位放電率僅為4.5％，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　 2.以TRP家族阻斷劑RR100μm孵育受損DRG神經(jīng)元，孵育5-10分鐘后，

11、受損DRG神經(jīng)元的放電開始下降;孵育30分鐘后，神經(jīng)元的放電幾乎被完全阻斷。較CCD組受損DRG神經(jīng)元異位放電的頻率和波幅均明顯下降(n=10，p＜0.05);
　　 3.以TRPV4特異激動劑佛波醇(4α-phobol12，13-didecanoate，4α-PDD)1nm、1μm、10μm的劑量孵育受損DRG。孵育20-30分鐘后，與CCD組受損DRG神經(jīng)元異位放電相比，1nm、1μm4α-PDD組受損DRG神經(jīng)元異位放電未

12、出現(xiàn)明顯變化(bothp＞0.05);10μm4α-PDD組受損DRG神經(jīng)元放電頻率和波幅均明顯增加(n=10，p＜0.05)。
　　 4.神經(jīng)行為學(xué)
　　 4.1.運(yùn)動功能所有動物在損傷前后步態(tài)均正常，足無畸形，評分均為1分，損傷前、后各組間無顯著性意義;
　　 4.2.機(jī)械痛閾值和熱輻射刺激縮爪反應(yīng)潛伏期手術(shù)前，各組大鼠的機(jī)械縮爪閾基礎(chǔ)值無差別。持續(xù)壓迫明顯降低大鼠損傷側(cè)的機(jī)械痛閾值和熱輻射刺激縮爪反應(yīng)潛伏期

13、，手術(shù)組各時(shí)間段大鼠右后肢機(jī)械痛閾值和熱輻射刺激縮爪反應(yīng)潛伏期的改變具有顯著性差異(P＜0.05)，空白對照組及各假手術(shù)組各時(shí)間段的兩痛閾值無明顯改變;
　　 5.HE染色結(jié)果顯示:術(shù)后7天時(shí)受損的DRG神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯組織水腫，間質(zhì)血管充血，可見炎性細(xì)胞浸潤;術(shù)后14天時(shí)受損的DRG神經(jīng)元的神經(jīng)外膜和神經(jīng)纖維水腫明顯，間質(zhì)仍充血，神經(jīng)元空泡樣變性，核固縮，局部大量炎細(xì)胞浸潤;術(shù)后28天時(shí)受損DRG神經(jīng)元的神經(jīng)外膜水腫減輕，神