弓形蟲1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)基因的克隆、表達及生化特性研究.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種呈世界范圍分布的人獸共患寄生原蟲,給人類生活和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來極大的危害,迄今免疫預(yù)防控制弓形蟲病仍未取得突破性進展。目前臨床可用的特效藥物較少,尋找高效、低毒的新型抗弓形蟲藥物仍是弓形蟲病研究的重要方向之一。類異戊二烯化合物是生物體所必需的,而2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2C-methyl-D-erythritol-4-Plaosphate,MEP)途徑是一種廣泛存在于植物、

2、細菌和多種頂復(fù)門原蟲的類異戊二烯合成代謝途徑,該途徑在人和動物體內(nèi)不存在。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(1-deoxy-D-xylulose-5-pllosphate reductoisomerase,DXR)是類異戊二烯代謝的MEP途徑中的第二個反應(yīng)酶,該酶是研制抗菌和抗原蟲藥物的潛在靶標。本研究根據(jù)弓形蟲基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.toxodb.org)的T.gondii DXR基因序列,進行克隆和原核表達,分析

3、研究了其酶動力學(xué)和抑制動力學(xué)特征。試驗具體分為以下幾個部分:
　　 首先根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫中注釋預(yù)測的TgDXR的ORF序列設(shè)計特異性引物,以弓形蟲速殖子總RNA為模版,反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈,用PCR方法成功擴增出包含整個ORF的序列片段。TgDXR的ORF全長為1542 bp,編碼一個由513個氨基酸組成的多肽,理論分子量為55.7 kD。信號肽預(yù)測和多序列比對結(jié)果表明,其N-端包括由22個氨基酸組成的信號肽和43個氨基酸組成

4、的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽,成熟的TgDXR蛋白共由448個氨基酸組成,分子量為48.6 kD。與其它物種DXR的氨基酸序列相似性在36—63％之間,三維結(jié)構(gòu)分析顯示預(yù)測的TgDXR單體蛋白中含有的α螺旋,β折疊,β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別為45.1％,22.9％,8.7％,和23.3％。
　　 利用DNA重組技術(shù),選擇不同的原核表達載體(pET-32a(+)、pMAL-c2x),利用E.coli Rosseta(DE3)重組表達TgDXR的不同序列

5、片段(TgDXR1:完整的ORF；TgDXR2:不包括信號肽和轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的功能片段)。結(jié)果顯示兩個重組載體都能夠得到表達；但pET-32a(+)-TgDXR重組表達蛋白以包涵體的形式存在,pMAL-c2x-TgDXR表達蛋白大部分存在于上清中。
　　 純化pMAL-c2x-TgDXR表達的重組蛋白進行酶動力學(xué)及抑制動力學(xué)分析,結(jié)果顯示,重組TgDXR(rTgDXR)能夠在二價金屬離子Mn2+的存在下,氧化NADPH并催化1-脫氧-D