自體骨髓間充質干細胞用于小型豬全脫位牙延遲再植的實驗研究.pdf

1、牙全脫位(Completely avulsed teeth，CAT)是造成兒童年輕恒牙早失的主要疾病之一。牙齒離體時間、細胞活力和微環(huán)境是影響牙再植治療成功與否的主要因素。研究證實，當牙齒離體1個小時，且沒有保存在特殊的儲存液中，根面幾乎找不到生活的牙周成纖維細胞，而牙根及牙槽窩中是否存有足夠生活的組織細胞對外傷牙牙周組織的愈合起著決定性的作用。然而，牙外傷多為突發(fā)事件，上述因素很難在就診前被控制，目前，臨床醫(yī)師多采取國際牙外傷聯(lián)合委員

2、會制定的各類牙外傷操作指南進行臨床治療，對于CAT主要依靠患者自身的再生能力來完成整個牙周組織的損傷修復，療效十分局限，加之干擾因素較多，個體間可比性差，臨床治療難以得到突破性進展。近年來組織工程技術在牙周再生治療中已顯現(xiàn)出了優(yōu)勢，如果能在牙根表面和牙槽窩中回植足夠數(shù)量的生活細胞，那么牙齒離體時間的長短對治療效果的影響將會大大降低。研究表明牙周膜干細胞是牙周組織理想再生的首選細胞，然而自體牙周膜干細胞來源有限，尤其是在外傷牙的案例中更難

3、獲得。近年來非牙源性干細胞再生牙齒組織已成為一種選擇。在諸多非牙源性干細胞中，骨髓間充質干細胞是較為成熟的一類，研究證明在適當?shù)奈h(huán)境中，骨髓間充質干細胞亦可分化成類成牙骨質細胞，類牙周膜細胞和類骨細胞，完成理想牙周復合體再生的過程，異體移植所帶來的潛在風險也將會避免，這將極大推進全脫位牙再植治療效果，降低并發(fā)癥帶來的失牙風險。然而將自體骨髓間充質干細胞應用于CAT延遲再植的相關研究尚未見報道，為了進一步評價此方法在臨床應用中的可行性，

4、本研究將著力探討骨髓間充質干細胞再生牙周組織的潛力，并利用小型豬建立全脫位牙動物模型，探討骨髓間充質干細胞再生牙周復合體的相關機理，為自體非牙源性干細胞再生牙體組織尋找理論依據(jù)。本研究包括以下三個部分:
　　第一部分，小型豬骨髓間充質干細胞的體外培養(yǎng)和鑒定
　　目的:建立穩(wěn)定的小型豬骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)體系，并對所獲細胞進行初步鑒定，為后期研究提供基礎和前提。
　　方法:以四川達碩小型豬為研究對象，全麻下抽取其髂骨

5、骨髓血，采用Ficoll淋巴細胞密度梯度離心法處理血樣，待樣本分層后，吸取單核細胞層細胞進行細胞培養(yǎng)。倒置顯微鏡、流式細胞儀，細胞生長曲線，免疫組化染色，酶聯(lián)免疫檢測儀等對所獲細胞生長特性，多項誘導分化能力和表面特異標記物進行觀察和分析，初步鑒定干細胞的相關生物學特性。
　　結果:鏡下觀分離所獲小型豬骨髓間充質干細胞成長梭形渦旋式生長，生長狀態(tài)良好。P1細胞克隆形成率為10.28±0.69％，活細胞比率為98.17±1.89％，流

6、式細胞檢測細胞表面特異標記物CD44和CD105呈陽性表達，分別為76.5％和92.6％; CD45和CD34呈陰性表達，分別為5.9％和2.3％。多項誘導分化實驗證實小型豬間充質干細胞有成骨成脂分化潛能。
　　結論:本實驗采用Ficoll淋巴細胞密度梯度法成功分離獲得小型豬骨髓間充質干細胞，分離所獲細胞增殖能力旺盛，具有跨胚層橫向分化潛能。
　　第二部分，小型豬牙周膜干細胞誘導骨髓間充質干細胞牙向分化的體外研究
　　

7、目的:在體外研究小型豬牙周膜干細胞對其髂骨骨髓來源的骨髓間充質干細胞牙向分化的作用，尋找二者最佳配比比例，為證明骨髓間充質干細胞可以獲得牙源性干細胞特性，具備同時再生牙周軟硬組織，達到牙周理想再生的能力尋找理論依據(jù)。
　　方法:應用Transwell小室法對小型豬骨髓間充質干細胞和其牙周膜干細胞進行共培養(yǎng)。根據(jù)兩類細胞的混合比例將其隨機分為3組:A組:P∶M=10∶1共培養(yǎng)組;B組:P∶M=1∶1共培養(yǎng);C組:P∶M=1∶10共培

8、養(yǎng)，單獨骨髓間充質干細胞和牙周膜干細胞培養(yǎng)組分別為陰性對照組和陽性對照組。培養(yǎng)14 d，應用免疫熒光染色，實時定量PCR(Realtime-PCR)和Western blot法分別檢測成骨細胞和牙周成纖維細胞的特異蛋白:scleraxis、osteocalcin(OCN)、osterix(OSX)、matrixextracellular phosphoglycoprotein(MEPE)等mRNA和蛋白水平的表達，以判定二者的最佳配比比

9、例。
　　結果:免疫熒光染色，Realtime-PCR和Western blot結果顯示，A、B、C三個實驗組與陰性對照組相比，牙周膜干細胞特異蛋白sceleraxis，MEPE和骨髓間充質干細胞相關特異蛋白OCN和OSX相對mRNA表達水平均出現(xiàn)上調。數(shù)據(jù)顯示:A組對四種蛋白的表達水平最高。其中在牙周特異蛋白sceleraxis，MEPE的表達上A組與其它兩組之間出現(xiàn)了明顯的差別，差異有統(tǒng)計學意義P＜0.05。而在骨髓特異蛋白O

10、CN和OSX的表達上，雖然仍高于其他兩組，但差異無統(tǒng)計學意義P＞0.05。此外，B、C兩組與陰陽兩個對照組相比，以上四種蛋白的表達水平均出現(xiàn)了較為明顯的變化，如:sceleraxis，MEPE的表達均高于陰性對照組，但還達不到陽性對照組的水平，而OCN和OSX的表達均高于兩個對照組，尤其是OSX與陽性對照組相比有更為顯著的差別，P＜0.01。但B、C兩組之間各蛋白的表達均未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，P＞0.05。
　　結論:聯(lián)合培養(yǎng)可促進骨

11、髓間充質干細胞獲得部分牙周膜干細胞的特性，且少量的牙周膜干細胞同樣可以促進骨髓間充質干細胞獲得牙源性干細胞特性。
　　第三部分，小型豬自體骨髓間充質干細胞應用于全脫位牙延遲再植治療的體內研究
　　目的:在體內研究誘導自體骨髓間充質干細胞在牙延遲再植治療中再生牙周復合體的作用，探索適合臨床實際操作的全脫位牙牙周組織再生技術。
　　方法:選擇6只3-4月齡四川達碩小型豬的60顆牙齒為研究對象。實驗前2周，準備P3自體imp

12、BM-MSCs（P∶M=1∶10共培養(yǎng)14天），mpBM-MSCs和mpPDLSCs。術前并將各類細胞調整至2×107個/ml備用，手術建立全脫位牙模型，將拔除的受試牙至于體外干燥環(huán)境中滯留1h，并在回植前，刮除牙根表面牙周膜組織。根據(jù)回植細胞種類，將其劃分為4組:A組:空白對照組，直接將牙根表面處理后回植至牙槽窩;B組:mpBM-MSCs回植組;C組:impBM-MSCs回植組;D組:mpPDLSCs回植組。術后6w檢測牙周再生相關臨

13、床和影像學指標，制作組織學切片觀察牙周再生組織結構，并應用Realtime-PCR檢測牙周組織特意蛋白COLI，Scleraxis，MEPE和DSPP等蛋白相對mRNA表達水平，了解各組牙周再生能力。
　　結果:成功建立牙齒全脫位模型。術后6w對各組受試牙齒的臨床檢測發(fā)現(xiàn)，經過三類細胞介導的牙齒延遲再植治療組與空白對照組相比，PD，GR，Al，BI指數(shù)均較低，基本可以達到術前水平?？瞻捉MGR出現(xiàn)負值，說明牙齦出現(xiàn)退縮。在牙齒松動度

14、的檢測上，空白對照組與另外3組相比，仍有近3度的松動，而3個實驗組松動度基本恢復到術前標準。影像學檢測結果顯示，空白對照組出現(xiàn)了常見的牙再植術術后并發(fā)癥-牙根外吸收，較為嚴重的出現(xiàn)了病理性骨折，而經過細胞介導的牙再植治療，牙齒幾乎沒有出現(xiàn)以上并發(fā)癥，但部分牙齒的局部出現(xiàn)淺表性吸收，但范圍較小。組織學切片觀察顯示，經過細胞介導的實驗組均出現(xiàn)了牙周膜組織再生，在切片中可以清晰辨認牙周韌帶，Sharp穿通纖維和血管等解剖學結構，而空白對照組僅

15、在牙根局部發(fā)現(xiàn)少量的正常牙周膜組織，大部分牙周組織結構破壞，牙根外吸收是主要的病理學改變。在牙周組織特意蛋白DSPP和COLI的表達上，B組較C、D兩組低，但差異無統(tǒng)計學意義。在其它兩個蛋白的比較中，三組表達水平相似，也無統(tǒng)計學差異，P＞0.05
　　結論:自體impBM-MSCs可以在移植后獲得更多牙源特性，治療效果近似PDLSCs，較直接通過自體mpBM-MSCs移植具有一定優(yōu)勢，但考慮臨床實際可實施性，認為單獨回植自體mpB