多維液相色譜質(zhì)譜組合分析在志賀菌蛋白組基因組學(xué)中的應(yīng)用.pdf

1、隨著全基因組測(cè)序分析技術(shù)的快速發(fā)展，大量生物體的全基因組序列分析工作相繼完成。對(duì)這些基因組的精確注釋是其它組學(xué)研究的源泉和基礎(chǔ)。目前，盡管通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)蛋白編碼基因的可靠性在提高，但是由于其局限性仍會(huì)引起不少注釋錯(cuò)誤和遺漏。近年來(lái)，利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法完善基因組注釋成為國(guó)際上的一個(gè)研究熱點(diǎn)。由此誕生了一門新興學(xué)科一蛋白組基因組學(xué)(proteogenomics)，通過(guò)將質(zhì)譜鑒定出的肽段定位到相應(yīng)的基因組骨架上，從而把蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和

2、基因組注釋進(jìn)行有機(jī)整合。發(fā)展快速高通量的蛋白組基因組學(xué)研究方法仍是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。研究表明二維液相色譜聯(lián)用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（2-DLC-MALDI-TOF/TOF）和二維液相色譜聯(lián)用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(2-DLC-ESI-MS/MS)的多維液相色譜質(zhì)譜的組合分析可以提高鑒定蛋白的覆蓋率，但目前還未見(jiàn)這種技術(shù)方法在基因組注釋中的應(yīng)用。我們實(shí)驗(yàn)室率先在國(guó)際上完成了志賀菌所有四個(gè)血清群代表株的全基因組序列分析工作，這使

3、其成為一個(gè)理想的蛋白組基因組學(xué)研究對(duì)象。
　　 本研究擬構(gòu)建2-DLC-MALDI-TOF/TOF和2-DLC-ESI-MS/MS的組合分析體系以期有效地完善福氏志賀菌的基因組注釋。
　　 首先根據(jù)溶解性的不同對(duì)福氏2a志賀菌301株（S.flexneri2astr.301，Sf301）的全蛋白樣品進(jìn)行預(yù)分離，順序抽提胞漿蛋白和膜蛋白，經(jīng)胰酶消化后通過(guò)離線的2-DLC-MALDI-TOF/TOF和在線的2-DLC-ESI

4、-MS/MS的組合鑒定分析，所用檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為福氏2a志賀菌301株的6個(gè)讀碼框數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索引擎分別為MASCOT和SEQUEST。最終結(jié)果如下：
　　 從蛋白水平驗(yàn)證了1231個(gè)已注釋基因的表達(dá)，其在等電點(diǎn)pI、分子量MW和疏水性GRAVY方面的分布趨勢(shì)與福氏2a志賀菌301株基因組已注釋的4443個(gè)蛋白產(chǎn)物的分布一致。同時(shí)鑒定的蛋白涵蓋了蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)(clustersoforthologousgroupsofprot

5、eins，COGs)22功能分類組中20個(gè)，提示組合鑒定能夠較好的體現(xiàn)了所用生物樣品的蛋白質(zhì)組構(gòu)成情況；確認(rèn)了306個(gè)假定(hypothetical)基因的表達(dá)，占福氏2a志賀菌301株總假定基因的16％;借助獨(dú)創(chuàng)的“N-末端延伸數(shù)據(jù)庫(kù)”分析方法和RT-PCR的進(jìn)一步驗(yàn)證,3個(gè)基因(yhdP、yebJ和smpA)的翻譯起始位點(diǎn)得到修正;另外發(fā)現(xiàn)兩個(gè)由于測(cè)序錯(cuò)誤造成的注釋錯(cuò)誤：假基因zwf更正為“6-磷酸葡萄糖脫氫酶”的編碼基因，fusA

6、的3'末端往下游延伸240bp;完善基因組注釋最突出的貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)了34個(gè)未注釋的新基因，其中包括5個(gè)在其他腸道桿菌有注釋而在福氏2a志賀菌301株未注釋的基因以及29個(gè)全新的基因。9個(gè)新基因得到了RT-PCR或Northernblot的進(jìn)一步驗(yàn)證。這些新基因的功能值得進(jìn)一步研究。
　　 本研究還對(duì)2-DLC-MALDI-TOF/TOF和2-DLC-ESI-MS/MS組合體系本身進(jìn)行了綜合分析和比較。在對(duì)鑒定肽的性質(zhì)比較中發(fā)現(xiàn)，M

7、ALDI更傾向于離子化偏短的、堿性的、胰酶消化后C末端為精氨酸的肽段；ESI更傾向于離子化偏長(zhǎng)的、疏水性的、胰酶消化后C末端為賴氨酸的肽段。經(jīng)過(guò)優(yōu)化組合，該組合分析體系大大提高了鑒定蛋白質(zhì)的“質(zhì)”和“量”。
　　 綜上所述，我們首次將2-DLC-MALDI-TOF/TOF和2-DLC-ESI-MS/MS組合體系應(yīng)用到完善基因組注釋工作中。由于MALDI和ESI的互補(bǔ)性，這種組合分析體系無(wú)論在蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量上還是可信程度上都要優(yōu)于