pORF5質(zhì)粒蛋白抑制LL37抗菌肽促進(jìn)沙眼衣原體感染及機(jī)制初步研究.pdf

1、目的：沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）易造成持續(xù)性感染而引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，但其致病機(jī)制尚不明確。已有研究表明人源性抗菌肽LL37對衣原體的感染起到一定的抑制作用。pORF5是由Ct質(zhì)?；蚓幋a并且分泌到宿主細(xì)胞胞漿的分泌性蛋白，與衣原體致病密切相關(guān)。本研究擬探討Ct質(zhì)粒蛋白pORF5是否通過抑制 LL37促進(jìn)衣原體感染，并初步探討其分子機(jī)制，為 Ct致病機(jī)制的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：將已構(gòu)建

2、好的pGEX-6p-1/pORF5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue菌株，篩選pORF5重組蛋白表達(dá)菌，0.2mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白經(jīng)親和層析純化及蛋白酶切除 GST標(biāo)簽，制備純化的pORF5蛋白；SDS-PAGE和Western blotting分析和鑒定pORF5蛋白，BCA法測定pORF5蛋白濃度并用鱟試劑對內(nèi)毒素進(jìn)行檢測；30μg/mL的pORF5和用20μg/mL的LL37單獨(dú)或者共同孵育

3、衣原體后感染HeLa細(xì)胞28h，間接免疫熒光技術(shù)檢測不同處理組衣原體包涵體的形成數(shù)量、大小和形態(tài)變化；收集共孵育6h后的HeLa細(xì)胞，QPCR技術(shù)檢測TNF-α的表達(dá)情況；衣原體單獨(dú)或與30μg/mL的pORF5孵育后感染HeLa細(xì)胞，收集共孵育6h后的HeLa細(xì)胞，QPCR技術(shù)檢測 TNF-α的表達(dá)情況；用濃度為10～30μg/mL的pORF5蛋白和濃度為20～50μg/mL的LL37單獨(dú)或共同刺激HeLa細(xì)胞，28h后收集細(xì)胞，流式

4、技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　(1) pGEX-6p-1/pORF5成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue菌株，并可高效表達(dá)GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白經(jīng)蛋白酶酶切后得到高純度的pORF5蛋白，純度約為95％。
　　(2)當(dāng)pORF5蛋白濃度為10μg/mL時(shí)細(xì)胞凋亡率為5.75%，當(dāng)pORF5蛋白濃度提高到20μg/mL時(shí)細(xì)胞凋亡率為9.42%，當(dāng)pORF5蛋白濃度達(dá)到30μg/mL時(shí)細(xì)胞凋亡率為17.5

5、2%， pORF5蛋白可誘導(dǎo) HeLa細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞凋亡率隨pORF5蛋白濃度的升高而增加。
　　(3)間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn) pORF5蛋白能降低 LL37對衣原體感染的抑制作用，空白對照組衣原體包涵體形成單位(inclusion-forming unit， IFU)為3.80×105/mL，20μg/mL LL37處理組IFUs為2.00×105/mL，30μg/mL pORF5處理組IFUs為3.00×105/mL，20μg

6、/mL LL37和30μg/mL pORF5共同處理組IFUs為3.07×105/mL。pORF5蛋白單獨(dú)處理組和pORF5蛋白與LL37共同處理組IFUs明顯高于 LL37處理組，差異具有顯著性（P<0.05）；與空白對照組相比較， pORF5蛋白單獨(dú)處理組和pORF5蛋白與LL37共同處理組，IFUs無顯著性差異。
　　(4)實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與LL37單獨(dú)處理組相比較，pORF5蛋白和LL37共同處理組TNF-α的相