UBASH3A和UBASH3B基因單核苷酸多態(tài)性及mRNA表達(dá)與SLE的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erythematosus，SLE）為系統(tǒng)性自身免疫性疾病中的一種，以產(chǎn)生各種自身抗體，免疫復(fù)合物累積以及體內(nèi)多種器官、組織急性和慢性炎癥為其主要特征，且臨床表現(xiàn)各異，可從輕微的臨床癥狀（如皮疹或非侵蝕性關(guān)節(jié)炎）到危及生命的全身各臟器受累（如狼瘡腎炎，神經(jīng)精神紊亂等）。目前其病因尚未明確，可能是遺傳因素、環(huán)境因素及交互作用等共同影響，而引起一系列異常免疫反應(yīng)的結(jié)果。

2、r>　　SLE患病率在不同地區(qū)和種族人群中不相一致。在美國，SLE的患病率在15-144/10萬之間，瑞典人群 SLE患病率在46-85/10萬；韓國 SLE患病率在18.8-21.7/10萬，中國人群SLE患病率約70/10萬，而香港人群SLE患病率約為60/10萬。有證據(jù)表明，遺傳因素在此病的致病機(jī)制上起著重要作用。全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-Wide Association Studies，GWAS）和候選基因的研究在鑒別系統(tǒng)

3、性紅斑狼瘡風(fēng)險基因位點(diǎn)上已取得不少進(jìn)展，也為多基因遺傳性疾病致病機(jī)制的探索以及發(fā)展具有潛力靶點(diǎn)藥物的選擇提供了依據(jù)。當(dāng)前，經(jīng)遺傳缺失角度研究SLE的致病機(jī)制已成為相關(guān)研究的熱點(diǎn)。
　　蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein Tyrosine Phosphatase，PTPs）是調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路中的關(guān)鍵酶。蛋白酪氨酸磷酸化在包括細(xì)胞生長、分化、突觸傳遞、遷移、糖代謝以及免疫反應(yīng)等在內(nèi)的眾多重要生理進(jìn)程中發(fā)揮著作用。第一個 PTP序列大約在

4、26年前被發(fā)現(xiàn)，目前人類基因家族大約有100余種基因；蛋白酪氨酸磷酸化主要是由PTPs和蛋白酪氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinases，PTK）相互進(jìn)行控制的。PTPs在體內(nèi)活性的調(diào)節(jié)伴隨著多種機(jī)制，包括信使RNA（Messenger RNA，mRNA）的選擇性剪切、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)水平、二聚化和翻譯后修飾和亞細(xì)胞定位等。PTPs參與以酪氨酸磷酸化為基礎(chǔ)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能中的調(diào)節(jié)，通過胞內(nèi)蛋白中的酪氨酸殘基去磷酸化而起作

5、用。PTPs作為PTK的天然拮抗劑，可以通過抑制T細(xì)胞受體信號通路，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能和免疫穩(wěn)態(tài)中起到作用。近年來，有證據(jù)表明PTPs家族相關(guān)基因參與多種細(xì)胞信號通路，其活性失衡可能參與人類自身免疫性疾病、糖尿病、肺結(jié)核及癌癥等疾病的發(fā)生。攜帶有與疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）位點(diǎn)的PTPs可能將成為良好的候選基因，這也許與它們參與了抑制自發(fā)性 T細(xì)胞激活，通過去磷酸化

6、，使T細(xì)胞相關(guān)激酶以及它們的底物失活而抑制反應(yīng)有關(guān)。
　　UBASH3A(也稱為TULA或STS-2)和UBASH3B(也稱為TULA-2或STS-1)是新近發(fā)現(xiàn)的PTPs家族成員，可能為具有多種細(xì)胞功能的新型調(diào)節(jié)劑；它們編碼 TULA家族蛋白，在 T細(xì)胞和血小板中可下調(diào)受體介導(dǎo)的信號通路。TULA蛋白家族具有40％的序列相同性。UBASH3B基因廣泛表達(dá)于機(jī)體各組織，而UBASH3A基因則主要在脾、腎、肺、骨髓等器官以及外周血淋

7、巴細(xì)胞、造血細(xì)胞中表達(dá)。這兩種蛋白氨基酸序列中均擁含有一個N-末端的與泛素相關(guān)的結(jié)構(gòu)；中間的Src同源3（SrcHomology3，SH3）結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)與富含脯氨酸的CBL相結(jié)合，以及C-末端的磷酸甘油酸變位酶（Phosphoglycerate Mutase，PGM）結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)蛋白二聚化（見圖1）。
　　現(xiàn)有GWAS和侯選基因的遺傳關(guān)聯(lián)研究提示，UBASH3A和UBASH3B基因SNPs可能與多種不同的自身免疫性紊亂，如Ⅰ型糖尿

8、病、白癜風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乳糜瀉、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦膜炎、白塞病等存在關(guān)聯(lián)，但結(jié)論不盡一致。如在英國和丹麥人群發(fā)現(xiàn)UBASH3A基因與Ⅰ型糖尿病存在遺傳易感性關(guān)聯(lián)，但在丹麥、法國、德國等多個國家RA病人開展的遺傳易感性研究和Meta分析未能驗(yàn)證UBASH3A基因與度、主要臨床特征以及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系。探討上述基因mRNA表達(dá)在SLE致病機(jī)制中可能發(fā)揮的作用。
　　

9、綜上，我們通過分析基因單核苷酸多態(tài)性及mRNA表達(dá)與SLE患病的關(guān)聯(lián)性結(jié)果來驗(yàn)證UBASH3A和UBASH3B基因與中國人群 SLE發(fā)病的關(guān)聯(lián)性，并且假設(shè)不同臨床特征 SLE患者UBASH3A和UBASH3B的表達(dá)存在差異，推測UBASH3A和UBASH3B可能是需要經(jīng)探索的基因治療靶點(diǎn)，進(jìn)而為 SLE病患早期發(fā)現(xiàn)以及臨床決策提供參考依據(jù)。
　　目的：
　　探討SLE患者和健康對照UBASH3A基因(rs3788013，rs

10、2277798，rs1893592和rs11203203)和UBASH3B基因rs4936742位點(diǎn)與中國人群SLE遺傳易感性的關(guān)聯(lián)；同時結(jié)合調(diào)查問卷資料探討相關(guān) SNP位點(diǎn)多態(tài)性與主要臨床特征以及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的聯(lián)系；比較 SLE病例和健康對照之間，SLE并發(fā)LN病例和非LN病例，不同疾病活動期病例外周血單個核細(xì)胞UBASH3A和UBASH3B基因mRNA表達(dá)水平差異，分析其與疾病活動度、主要臨床特征以及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)聯(lián)，并探討上述基

11、因多態(tài)性及基因轉(zhuǎn)錄水平在SLE發(fā)生和發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　用于基因分型的研究對象1569例，其中SLE病例組樣本792例，收集來自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和安徽省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科的門診以及住院患者問卷資料和血樣 DNA。病例的診斷由兩名副主任醫(yī)師以上級別的?？漆t(yī)師確診，且均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1997年修訂的 SLE分類標(biāo)準(zhǔn)；同時與其它疾病，如惡性網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增多癥、溶血性貧血、血小板減少癥和結(jié)締組織病等進(jìn)行鑒別，排

12、除非SLE病例。研究對象收集時間范圍2012年9月-2014年10月，歷時約兩年多，并排除復(fù)診的SLE病例和不配合者。
　　用于基因分型的健康對照777例，來自健康體檢中心和安徽醫(yī)科大學(xué)的健康獻(xiàn)血者，且排除SLE和其它的自免病史，被調(diào)查前一個月身體健康，無重大疾病史的獻(xiàn)血人群。另在上述兩所三甲醫(yī)院中選取用于mRNA分析的研究對象62例，其中32例SLE病例和30例健康對照，其分類診斷和納入排除標(biāo)準(zhǔn)同上。對照為年齡、性別與病例具有可

13、比性的健康獻(xiàn)血者。
　　采用本課題組設(shè)計的問卷進(jìn)行資料收集，內(nèi)容包括（研究對象人口學(xué)特征、臨床特征以及實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果等），由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員采用面對面訪視的方式收集 SLE患者的相關(guān)資料，并結(jié)合醫(yī)院電子病歷信息系統(tǒng)進(jìn)行資料補(bǔ)充；同時，提取所有被調(diào)查對象的外周靜脈血各5ml，利用Fluidigm192.24 Dynamic Array儀以及TaqMan探針進(jìn)行基因分型檢測，分析UBASH3A和UBASH3B基因5個SNP位點(diǎn)的單

14、核苷酸多態(tài)性；比較在SLE病例組和對照組，LN病例組與非 LN病例組中各 SNP位點(diǎn)的基因型、等位基因的頻率分布情況，對顯性模型和隱性模型進(jìn)行分析和計算；分析各位點(diǎn) SNP多態(tài)性與相關(guān)臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系。應(yīng)用RT-qPCR分析PBMC中UBASH3A和UBASH3B基因mRNA的表達(dá)情況，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較組間差異，利用Spearman等級相關(guān)分析 UBASH3A和UBASH3B基因 mRNA表達(dá)水平與臨床

15、資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)聯(lián)。
　　利用SPSS11.5軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)強(qiáng)度用比值比（odds ratio，OR）及95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表達(dá)，并且用Logistic回歸分析計算經(jīng)年齡和性別校正后的OR值和95% CI；檢驗(yàn)效能和所需樣本量估算用Power and Sample Size Calculation軟件，基因單倍型分析采用在線SHEsis軟件。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α假定為0.05。

16、r>　　結(jié)果：
　　（1）本研究 UBASH3A rs3788013，rs2277798，rs1893592，rs11203203和UBASH3B rs4936742五個位點(diǎn)的基因型分布在病例組和對照組均達(dá)到HWE平衡（P>0.05）。
　?。?） UBASH3A和UBASH3B基因多態(tài)性與SLE遺傳易感性關(guān)聯(lián)研究結(jié)果表明，UBASH3A基因rs3788013位點(diǎn)與SLE遺傳易感性存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（A vs. C：χ2=9.0

17、16，P=0.003，OR=0.795，95% CI0.684-0.924；AA vs. CC：χ2=5.965，P=0.015，OR=0.632，95% CI0.437-0.913；CA+AA vs. CC：χ2=5.736，P=0.017，OR=0.770，95% CI0.622-0.954）。UBASH3A基因rs2277798位點(diǎn)，rs1893592位點(diǎn)和rs11203203位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.

18、05）。另外，LN與非 LN病例在各位點(diǎn)等位基因及基因型頻率分布之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。UBASH3B基因位點(diǎn) rs4936742等位基因及基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　?。?）UBASH3A基因單倍型分析由UBASH3A基因rs2277798，rs11203203，rs3788013以及rs1893592四個位點(diǎn)構(gòu)建的單倍型在中國人群中存在七種常見單倍型結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，GGCA單倍型頻率SLE病

19、例組高于對照組(χ2=10.155，P=0.001，OR=1.61，95% CI1.20-2.17)；此外，SLE病例組GGAA單倍型頻率明顯低于對照組(χ2=6.221，P=0.012，OR=0.81，95% CI0.68-0.96)。
　　（4）SNP位點(diǎn)與臨床特征的關(guān)聯(lián)性結(jié)果顯示，SLE合并血管炎病例中，rs3788013位點(diǎn) AC基因型頻率高于不伴有血管炎病例(χ2=8.837，P=0.012)；rs2277798位點(diǎn) A

20、G基因型頻率在 SLE病例合并血尿者高于未伴血尿者(χ2=11.569，P=0.003)；rs1893592位點(diǎn)等位基因頻率與 SLE病例是否患口腔潰瘍存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)(χ2=5.301，P=0.021，OR=0.671，95% CI0.477-0.944)，與是否合并關(guān)節(jié)炎存在關(guān)聯(lián)(χ2=4.803，P=0.028，OR=0.765，95% CI0.602-0.972)，與病例是否合并皮疹之間存在關(guān)聯(lián)(χ2=4.130，P=0.042，

21、OR=0.776，95% CI0.608-0.991)。抗 ds-DNA陽性患者的 rs4936742位點(diǎn) TC基因型頻率高于抗ds-DNA陰性者(χ2=7.410，P=0.025)。
　?。?）UBASH3A mRNA表達(dá)情況及與主要臨床表型關(guān)聯(lián) SLE病例 PBMC中UBASH3A mRNA表達(dá)表達(dá)水平較健康對照組低（P=0.002），活動期 SLE病例組低于非活動期組（P=0.000），但狼瘡腎炎組病例與非狼瘡腎炎病例表達(dá)無

22、統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。SLE病例UBASH3A mRNA表達(dá)與白細(xì)胞降低、抗dsDNA抗體陽性以及抗 SSB抗體陽性存在負(fù)相關(guān)（rs=-0.380，P=0.032；rs=-0.385，P=0.030；rs=0.433，P=0.013），而SLE病例UBASH3A mRNA水平與其它臨床癥狀如關(guān)節(jié)炎、發(fā)熱、脫發(fā)等均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（P>0.05）；SLE病例UBASH3A mRNA表達(dá)與病例首次發(fā)病年齡相關(guān)（rs=-0.358，P=

23、0.044）；SLE病例UBASH3A mRNA水平與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.350，P=0.049）。
　?。?） UBASH3B mRNA表達(dá)情況及與主要臨床表型關(guān)聯(lián)本研究未發(fā)現(xiàn)UBASH3B基因mRNA表達(dá)水平在病例組與對照組，活動組與非活動組，腎炎病例組與非腎炎病例組以及與臨床表型、SLEDAI之間具有相關(guān)性（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　UBASH3A基因位點(diǎn) rs3788013多態(tài)性可能與漢族

24、人群 SLE患病遺傳易感性有關(guān)。UBASH3A基因位點(diǎn)構(gòu)建的單倍型GGCA可能增加SLE的患病風(fēng)險，GGAA可能降低SLE的患病風(fēng)險。rs3788013位點(diǎn)可能與SLE合并血管炎有關(guān)；rs1893592位點(diǎn)可能與 SLE合并口腔潰瘍、關(guān)節(jié)炎及皮疹有關(guān)；rs2277798位點(diǎn)可能與SLE合并血尿有關(guān)；rs4936742位點(diǎn)可能與SLE合并抗ds-DNA增加有關(guān)。SLE病例UBASH3A mRNA表達(dá)水平降低，且與部分臨床表型如白細(xì)胞下降、