腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證基因表達(dá)譜的比較研究.pdf

1、研究背景與目的: 中醫(yī)“證”是疾病發(fā)生過(guò)程中不同階段病因病機(jī)的高度概括，既然同一證有共同的臨床表現(xiàn)和病理機(jī)制，那么其肯定有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，而這種物質(zhì)基礎(chǔ)很有可能反應(yīng)在基因或基因組水平上。腎所藏之精稟受于父母，是構(gòu)成胚胎發(fā)育的原始物質(zhì)，其與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)描述的遺傳物質(zhì)（DNA）具有一定的同一性。因此，從基因組方面深入研究腎虛證的分子機(jī)制對(duì)于闡明腎虛證本質(zhì)有著重要意義。腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證是中醫(yī)學(xué)的基本證候，歷代醫(yī)家對(duì)腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證的理

2、論與防治研究都頗為重視。腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證作為疾病的某一階段的主要矛盾，必然受到“病”這一基本矛盾的影響。正是由于不同疾病的特異性，決定了不同疾病相同中醫(yī)證侯之間的差異；而同一疾病不同中醫(yī)證侯之間也存在差異。只有通過(guò)對(duì)這些差異的研究，進(jìn)而歸納出證的一般規(guī)律，才有可能對(duì)腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證有更全面的解析。因此，“病證結(jié)合”是研究腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證差異基因表達(dá)的重要思路。 本課題組在先前的腎陰虛證相關(guān)基因研究過(guò)程中，通過(guò)西醫(yī)辨病與中醫(yī)

3、辨證相結(jié)合，從糖尿病、慢性腎炎、狼瘡性腎病以及亞健康狀態(tài)等腎陰虛證入手，應(yīng)用RNA微量擴(kuò)增、抑制性消減雜交、基因克隆等技術(shù)和方法，成功地構(gòu)建了腎陰虛證的cDNA文庫(kù)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述不同病種腎陰虛證的消減文庫(kù)中存在明顯差異，而亞健康腎陰虛證的消減文庫(kù)與共同文庫(kù)很相似。這提示構(gòu)建的腎陰虛證cDNA消減文庫(kù)必定受到了疾病的干擾，即篩選出的部分差異基因可能與該疾病有關(guān)卻與腎陰虛證無(wú)關(guān)，亞健康腎陰虛證的消減文庫(kù)受到的干擾最小。這可能是因?yàn)閬喗】凳?/p>

4、介于健康和疾病之間的中間狀態(tài)，雖然未達(dá)到疾病，但已表現(xiàn)為中醫(yī)證候，屬于功能性改變。這提示亞健康對(duì)于中醫(yī)證候本質(zhì)研究有著非常重要的意義。 基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)是生物信息分析領(lǐng)域的一個(gè)革命性的里程碑，它具有高通量、微型化和自動(dòng)化的特點(diǎn)，已成為高效、快速、大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息的重要手段。作為一種新興的生物技術(shù)，基因芯片一出現(xiàn)即引起世界的廣泛關(guān)注。目前，基因芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥研究的許多領(lǐng)域。怎么把西醫(yī)的病與中醫(yī)的證統(tǒng)一起來(lái)呢？基

5、因表達(dá)譜也許是重要的連結(jié)點(diǎn)。因此，基因表達(dá)譜可為中醫(yī)證候本質(zhì)研究提供前所未有的契機(jī)。 綜上所述，本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，采用“病證結(jié)合”的方法，應(yīng)用基因芯片技術(shù)，開(kāi)展腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證基因表達(dá)譜的比較研究，尋找腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證的差異表達(dá)基因，探討腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證在基因水平可能的發(fā)生機(jī)制，為腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證的本質(zhì)研究提供科學(xué)依據(jù)。 方法: 1、采用“病證結(jié)合”方法，選取IgA腎病以及亞健康狀態(tài)腎陰虛證和腎

6、陽(yáng)虛證患者作為研究對(duì)象，確診為腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證患者，作為實(shí)驗(yàn)組；選擇健康志愿者作為正常對(duì)照組。 2、收集樣本，制備樣品，運(yùn)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行芯片雜交和掃描分析，研究腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證的基因表達(dá)譜。根據(jù)基因芯片分析結(jié)果，隨機(jī)選擇腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證的差異表達(dá)基因，進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。 3、結(jié)合MAS軟件分析，并使用檢索互聯(lián)網(wǎng)生物學(xué)公共數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www．genesifter．net/web/index．html

7、）提供的檢索程序?qū)Σ町惐磉_(dá)基因進(jìn)行分析。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋?zhuān)╤ttp：//www．geneontology．org），并利用KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genom，網(wǎng)址http：//www．genome．a(chǎn)d．jp）、BioCarta（http：//www．bioCarta．com）和GenMAPP （http：//www．genmapp．org）作pathway分析。 結(jié)果

8、: 1、腎陰虛證組和正常對(duì)照組間存在差異基因表達(dá)特征圖譜。獲得差異表達(dá)基因共79條。其中，表達(dá)水平上調(diào)（Ratio值大于2）的有6條，表達(dá)水平下調(diào)（Ratio值小于0．5）的有73條。這些差異表達(dá)的基因按功能分析進(jìn)行大體分類(lèi)，主要涉及到免疫功能、新陳代謝、蛋白質(zhì)生物合成、氧化應(yīng)激、遺傳信息過(guò)程、離子通道、蛋白質(zhì)氨基酸去磷酸化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)等方面；這些差異表達(dá)的基因涉及到多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如軸突導(dǎo)向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、蛋白

9、磷酸酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞質(zhì)囊泡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、絲裂酶原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。 2、腎陽(yáng)虛證組和正常對(duì)照組間存在差異基因表達(dá)特征圖譜。獲得差異表達(dá)基因共75條。其中，表達(dá)水平上調(diào)（Ratio值大于2）的有22條，表達(dá)水平下調(diào)（Ratio值小于0．5）的有53條。這些差異表達(dá)的基因按功能分析進(jìn)行大體分類(lèi)，主要涉及到免疫應(yīng)答、代謝通路、信號(hào)通路、細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞受體、細(xì)胞骨架和運(yùn)功、氧化

10、應(yīng)激、離子通道（鈣、鎂、鋅、銅）、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)翻譯合成等方面；這些差異表達(dá)的基因涉及到多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如粘著連接通路、細(xì)胞因子間受體相互作用通路、MAPK（絲裂酶原活化蛋白激酶）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、激活蛋白受體信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、鎂離子結(jié)合信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。 3、通過(guò)比較分析，腎陰虛證組和腎陽(yáng)虛證組基因表達(dá)譜存在明顯的差異，全部的差異表達(dá)基因有145條，詳細(xì)

11、分析見(jiàn)上述第1、2條。腎陰虛證組、腎陽(yáng)虛證組與正常對(duì)照組比較，二者共同的差異表達(dá)基因有9條如CA8（碳酸酐酶Ⅷ）、SYPL1（突觸泡蛋白樣1）、PHF14（PHD指蛋白14）、ARHGAP18（Rho GTP激活蛋白18）、PYROXD1（吡啶核苷酸氧化還原酶1）、RECQL（RecQ蛋白樣、DNA解旋酶Q1樣）、OSTF1（破骨細(xì)胞刺激因子1）、SEC23B（Sec23同源物B）、231418_at等。主要涉及到免疫功能、新陳代謝、細(xì)

12、胞周期、骨骼發(fā)育、DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)的合成等方面的功能。另外一條基因231418_at功能尚不明確。 結(jié)論: 1、基因芯片是研究中醫(yī)證候相關(guān)基因的比較理想的一種技術(shù)方法。 2、采用“病證結(jié)合”，開(kāi)展腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證基因表達(dá)譜的比較研究，初步獲得腎陰虛證的相關(guān)基因，共79條；初步獲得腎陽(yáng)虛證的相關(guān)基因，共75條。 3、腎陰虛證與腎陽(yáng)虛證差異表達(dá)基因存在明顯不同，提示可以為腎陰虛證和腎陽(yáng)虛證的中醫(yī)辨證分型提