源于VEGF的腫瘤靶向肽在荷瘤裸鼠核素顯像及治療中的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　腫瘤的核素顯像及治療是分子核醫(yī)學的研究熱點,其中受體介導的腫瘤核素顯像和靶向治療是該領域的前沿。它是以腫瘤細胞或細胞外基質中特異性高表達的受體為靶點,利用能與受體高親和力、高特異性結合的配體將放射性核素運載到腫瘤部位,從而達到腫瘤的核素顯像或靶向治療的目的。選擇在腫瘤組織中高表達的靶受體、并篩選能與該受體高親和力、高特異性結合的配體是研究的關鍵環(huán)節(jié)。
　　腫瘤的血管新生是腫瘤得以無限生長、局部浸潤和遠處

2、轉移的關鍵,在此過程中,血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)及其受體(VEGFR)起關鍵作用,阻斷 VEGF/VEGFR信號通路,能夠明顯地抑制腫瘤的生長、轉移,且VEGFR在多種腫瘤細胞及腫瘤血管內皮中高表達而在正常組織中低表達或不表達,表明VEGFR是腫瘤核素顯像和治療的理想靶點。
　　在課題的前期研究中,我們利用生物信息學的方法對多肽VEGF125-136片段進行

3、改造,并篩選到兩條新多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS。體內外實驗證實:該兩條多肽具有腫瘤靶向性;與VEGFR的親和力較VEGF125-136提高了6倍及2.5倍;能夠顯著抑制 A549細胞生長,抑制率分別為40％、70%。有望作為分子探針或靶向藥物用于腫瘤的分子顯像及靶向治療。
　　在此基礎上,本研究擬用治療型放射性核素188Re對該兩條小分子多肽進行標記、鑒定,并探討標記多肽在荷 A549移植瘤裸鼠中的

4、體內分布、核素顯像及治療作用,為其作為核素靶向藥物治療腫瘤奠定實驗基礎。
　　方法:
　　1.多肽的188Re標記及鑒定:分別以雙半胱氨酸(Ethylene Cysteine,EC)、MAG3、HYNIC作為雙功能螯合劑對小分子多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS進行188Re標記,選取最佳雙功能螯合劑和標記條件,并鑒定標記多肽在生理鹽水及人血清中的穩(wěn)定性。
　　2.構建過表達突變型 VEGFR-

5、1的 A549細胞株:利用慢病毒載體轉染突變型VEGFR-1基因至A549細胞中,免疫熒光觀察慢病毒轉染效率,熒光定量RT-PCR及蛋白免疫印跡法鑒定轉染后VEGFR-1的mRNA及蛋白表達水平。
　　3.188Re-多肽與A549細胞的結合特性鑒定:體外受體競爭結合實驗驗證188Re-多肽與A549細胞的結合能力。VEGFR-1受體飽和結合試驗、受體內化實驗探討多肽與VEGFR-1的結合特性。
　　4.188Re-多肽在荷

6、瘤裸鼠體內顯像及分布:SPECT平面顯像觀察標記多肽在荷A549腫瘤裸鼠的腫瘤靶向性,體內分布實驗定量分析標記多肽在各臟器的每克百分攝取率(%ID/g),計算腫瘤/肌肉比值。
　　5.188Re-多肽對荷A549腫瘤裸鼠的治療作用:分別以兩條標記多肽為治療組,生理鹽水、非標記多肽、Na188ReO4為對照組,通過生存分析、腫瘤生長曲線、腫瘤壞死及凋亡檢測,比較上述藥物對荷瘤裸鼠的治療作用。
　　結果:
　　1.成功通過

7、一步法對兩條 EC偶聯(lián)多肽進行188Re標記,標記率分別為(85.34±2.05)%及(90.9±3.45)%,明顯高于MAG3、HYNIC偶聯(lián)多肽。188Re-EC多肽在生理鹽水及人血清中穩(wěn)定性較好,放置24小時放射化學純度無明顯降低。
　　2.慢病毒載體轉染后,A549細胞中的熒光強度、VEGFR-1基因的mRNA及蛋白在表達水平明顯增強,表明成功構建過表達突變型VEGFR-1的A549細胞株。
　　3.體外受體競爭結合

8、實驗證實兩條標記多肽在體外能夠與 A549細胞特異性結合;VEGFR-1受體飽和結合實驗表明標記多肽可與VEGFR-1結合;受體內化實驗表明標記多肽可以通過VEGFR-1介導的內化作用進入胞內。
　　4. SPECT平面顯像及體內分布實驗示:標記多肽主要通過泌尿系統(tǒng)排泄,少部分通過肝臟排泄,在腦、肌肉、骨、肺等臟器中分布較少。注射標記多肽后2小時及6小時,腫瘤部位可見明顯放射性濃聚,腫瘤/肌肉比值( T/NT)分別為(4.67±1

9、.2),(4.91±1.23)及(5.87±1.3),(5.46±0.87),均明顯高于188Re-VEGF125-136組。
　　5.與對照組相比,188Re-多肽治療組能夠明顯延長荷A549腫瘤裸鼠的生存時間,抑制腫瘤的生長速度;病理學HE染色示治療組腫瘤組織中大量壞死;TUNEL凋亡染色示未壞死腫瘤細胞的凋亡比例明顯增加。
　　結論:
　　1.首次將 EC作為雙功能螯合劑用于多肽的188Re一步法標記,標記方法簡