AQP7在卵母細胞冷凍保存與成熟中的功能及其機制研究.pdf

1、1冷凍保護劑調(diào)節(jié)卵母細胞中AQP7表達而促進冷凍過程中水轉(zhuǎn)運的研究
　　目的:檢測卵母細胞中AQP7在卵母細胞冷凍保存中的作用
　　材料與方法:
　　1.收集行人MⅡ期卵母細胞和C57BL/6J小鼠MⅡ期卵母細胞，檢測水通道蛋白AQP3，7，9的mRNA和蛋白水平的表達。
　　2.比較卵母細胞在汞離子處理和不處理兩種情況下，卵母細胞的對低滲溶液膨脹能力和對水的轉(zhuǎn)運速率。
　　3.分別用8％乙二醇(EG)，9

2、.5％ DMSO和0.5 M蔗糖的HTF溶液處理卵母細胞，檢測AQP3，7，9蛋白的表達。
　　4.轉(zhuǎn)染表達GFP-hAQP7融合蛋白載體到293T細胞中，分別用EG，DMSO和蔗糖的DMEM溶液處理，實時監(jiān)測細胞中GFP-hAQP7蛋白表達變化。
　　5.使用顯微操作儀固定卵母細胞，實時監(jiān)測卵母細胞在EG，DMSO溶液中體積的變化。
　　6.比較使用EG和DMSO作為冷凍保護劑，卵母細胞的存活率。
　　結(jié)果:<

3、br>　　1.在人和小鼠的MⅡ期的卵母細胞中，都能檢測到AQP3，7，9的mRNA和蛋白水平的表達。
　　2.卵母細胞在汞離子處理后，對低滲溶液膨脹能力減弱，對水的轉(zhuǎn)運速率降低。
　　3.乙二醇(EG)，DMSO和蔗糖可使卵母細胞AQP7蛋白表達水平上調(diào)，并且DMSO處理后上調(diào)效應最強烈。而AQP3和9表達水平并沒有改變。
　　4.EG，DMSO和蔗糖可以上調(diào)293T細胞中GFP-hAQP7蛋白表達。并且同樣是DMSO

4、處理組GFP-hAQP7蛋白表達上調(diào)效應最明顯。
　　5.相比較EG，卵母細胞在DMSO溶液中體積的變化更快。
　　6.相比較EG，用DMSO做冷凍保護劑，卵母細胞冷凍保存后的存活率低。
　　結(jié)論:DMSO比EG更能刺激卵母細胞中AQP7表達上調(diào)。這個上調(diào)作用可以促進卵母細胞在冷凍保存過程中對水的滲透，減少卵母細胞達到滲透壓平衡時間。
　　2 AQP7在卵母細胞成熟和冷凍中的功能的研究
　　目的:闡明AQP

5、7在卵母細胞成熟和冷凍保存中的功能
　　材料與方法:
　　1.收集自然周期和控制超促排卵(COH)的小鼠MⅡ期卵母細胞，分別進行體外受精實驗。比較兩組細胞受精率。用Real-time PCR檢測兩組細胞AQP7 mRNA表達差異。
　　2.收集GV期和MⅡ期卵母細胞，運用Real-time PCR比較這兩種時期卵母細胞中AQP7的mRNA表達差異。運用細胞免疫熒光方法檢測AQP7蛋白在這兩種細胞中分布差異。
　　

6、3.采用顯微注射技術將AQP7 siRNA注射到GV期卵母細胞中，敲減AQP7的表達。與注射Sramble siRNA比較，計算卵細胞體外的成熟率。
　　4.收集自然周期的MⅡ期卵母細胞，分別用含有insulin，LH和FSH這三種激素的HTF培養(yǎng)細胞1h，采用免疫熒光方法檢測AQP7的在細胞內(nèi)的分布的改變。
　　5.收集GV,MⅠ和MⅡ期卵母細胞，采用免疫熒光方法檢測這三種時期的卵母細胞中AQP7與F-actin的共定位情

7、況。
　　6.分別使用EG和DMSO對卵母細胞玻璃化冷凍，解凍后和新鮮卵母細胞同時進行體外受精，計算受精率。
　　7.新鮮未冷凍的卵母細胞作為對照組，采用免疫熒光法檢測卵母細胞玻璃化冷凍解凍后2h后，AQP7的表達情況。
　　8.分別注射Sramble RNA和AQP7 siRNA到GV卵母細胞，體外培養(yǎng)16-18h后，使用EG進行玻璃化冷凍，解凍統(tǒng)計存活率。
　　結(jié)果:
　　1.COH組組卵母細胞體外受精

8、率明顯低于自然周期組，并且COH組MⅡ期卵母細胞AQP7 mRNA表達水平顯著低于自然周期組。
　　2.MⅡ期卵母細胞AQP7 mRNA表達水平顯著低于GV期。在MⅡ期卵母細胞中，相比較GV期而言，AQP7更多分布在細胞膜上，細胞質(zhì)重分布明顯減少。
　　3.注射靶向AQP7的siRNA到GV期卵母細胞中敲減AQP7表達后，卵母細胞成熟率顯著降低。
　　4.Insulin和LH處理后，AQP7在卵母細胞膜上分布增多，細胞

9、質(zhì)中分布減少。而使用FSH處理，AQP7分布并沒有改變。
　　5.GV, MⅠ和MⅡ期卵母細胞中都能檢測到AQP7與F-actin共定位。隨著卵母細胞的發(fā)育，AQP7在這三種時期細胞內(nèi)細胞質(zhì)中的分布減少，細胞膜上分布增多。而F-actin正好相反，在胞質(zhì)中的分布增多，細胞膜上分布減少。
　　6.使用DMSO或者EG作為冷凍保護劑凍存的卵母細胞解凍后體外受精能力沒有差異，均低于新鮮對照組。AQP7表達量在DMSO和EG組之間并

10、沒有顯著差異，但均高于未冷凍的對照組。
　　7.AQP7表達敲減后，卵母細胞冷凍保存后存活率是顯著降低。
　　結(jié)論:AQP7通過與F-actin共定位在一起，通過F-actin運輸作用，在卵母細胞從GV期發(fā)育到MⅡ期過程中從胞質(zhì)向胞膜上轉(zhuǎn)運，參與卵母細胞的成熟。敲減AQP7表達后，卵母細胞冷凍保存后的存活率顯著降低。
　　3冷凍保護劑和高滲透壓刺激卵母細胞中AQP7表達和定位的改變是通過PI3K/PKC通路調(diào)節(jié)的機制研

11、究
　　目的:明確冷凍保護劑和高滲透壓刺激卵母細胞中AQP7表達和定位改變的分子機制。
　　材料與方法:
　　1.采用細胞免疫熒光和蛋白免疫印(Western blotting)檢測卵母細胞上蛋白CPEB和AuroraA磷酸化和總蛋白在冷凍保護劑EG, DMSO和蔗糖溶液處理后的表達水平。
　　2.分別Staurosporine/HTF，LY294002/HTF，U0126/HTF，SP600125/HTF預處理

12、MⅡ期的卵母細胞，第五組為對照。再用8％EG/HTF溶液處理20min后采用免疫熒光方法檢測AQP7，CPEB，磷酸化CPEB，Aurora A和磷酸化Aurora A蛋白表達水平。
　　3.293FT細胞中表達GFP-hAQP7，同2使用方法處理，激光共聚焦顯微鏡下檢測GFP-hAQP7的表達量。用Western blotting檢測GFP-hAQP7蛋白水平。
　　4.用濃度分別為0.25M，0.5M，0.7M，1M蔗糖

13、的高滲透壓溶液分別處理卵母細胞20min，HTF為對照組，使用免疫熒光方法檢測各組AQP7的表達。
　　5.293FT細胞轉(zhuǎn)染GFP-hAQP7載體，48h后分別用DMSO，EG和蔗糖溶液處理20min，HTF組為對照。使用激光共聚焦顯微鏡下檢測各組GFP-hAQP7的表達。轉(zhuǎn)入pEGFP-C1載體作為對照。
　　6.對表達GFP-hAQP7的293FT細胞，裂解細胞，使用免疫共沉淀的方法檢測AQP7和F-ACTIN在細胞中

14、綁定情況。
　　結(jié)果:
　　1.EG, DMSO和蔗糖均可以上調(diào)卵母細胞中磷酸化的CPEB蛋白表達水平。DMSO組與EG組比較起來，DMSO上調(diào)磷酸化的CPEB蛋白表達更多。CPEB磷酸化的上游激酶Aurora A的磷酸化蛋白水平也被上調(diào)，DMSO上調(diào)效應最明顯?？偟鞍妆磉_水平不變。
　　2.PKC通路抑制劑Staurosporine和PI3K通路抑制劑LY294002可以顯著抑制冷凍保護劑EG對AQP7表達上調(diào)的效應

15、，而Erk1/2通路和JNK通路抑制劑對上調(diào)效應并沒抑制作用。在表達GFP-hAQP7的293FT細胞上發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果。
　　3.在卵母細胞水平上， PKC和PI3K通路抑制劑可以抑制CPEB和Aurora A磷酸化水平表達增高的效應。
　　4.AQP7表達水平隨著滲透壓增大而上升。并且隨著滲透壓增大，AQP7在細胞膜上分布增多。在表達GFP-hAQP7的293FT細胞上，冷凍保護劑所形成的高滲透壓溶液同樣也能刺激GFP-h