冷應(yīng)激對(duì)豬卵母細(xì)胞發(fā)育與CIRP表達(dá)的影響.pdf

1、結(jié)合采用豬卵巢卵母細(xì)胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）、體外受精(invitro fertilization，IVF)和體外培養(yǎng)（in vitro culture，IVC）等技術(shù)，是體外生產(chǎn)（in vitro production，IVP）豬胚胎的主要方式。在實(shí)踐過(guò)程中，卵巢運(yùn)輸、撿卵、卵母細(xì)胞處理和體外受精等，均需要一定的時(shí)間，難免會(huì)有溫度的變化，不可避免地會(huì)產(chǎn)生冷應(yīng)激反應(yīng)。豬卵母細(xì)胞對(duì)低溫的反應(yīng)較為敏感，低

2、溫刺激可對(duì)豬卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量，甚至受精后的發(fā)育能力產(chǎn)生不良影響。目前，大多關(guān)于冷應(yīng)激影響卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育的報(bào)道，都是在動(dòng)物個(gè)體水平進(jìn)行的，例如對(duì)母豬進(jìn)行冷應(yīng)激處理;而在細(xì)胞水平進(jìn)行冷應(yīng)激處理，如直接處理豬卵母細(xì)胞，研究冷應(yīng)激對(duì)其體外成熟等的影響，則少有報(bào)道;有關(guān)冷應(yīng)激過(guò)程中亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化及冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold inducible RNA-binding protein，CIRP)表達(dá)的研究在豬上尚未見(jiàn)報(bào)道。在冷應(yīng)激條件下

3、，細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成降低，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，但冷休克蛋白(cold shock proteins，CSP)在冷應(yīng)激條件下可大量表達(dá)。這類(lèi)蛋白主要參與細(xì)胞基本功能的調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的應(yīng)激保護(hù)作用。CIRP是迄今為止在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的少數(shù)冷休克蛋白之一。1997年，Nishiyama等首次從小鼠睪丸細(xì)胞中分離到CIRP的cDNA，并發(fā)現(xiàn)CIRP在細(xì)胞內(nèi)具有冷應(yīng)激保護(hù)功能。研究表明，CIRP在多種生物的細(xì)胞中呈組成型表達(dá)，

4、具有基因調(diào)控作用，并伴隨著冷應(yīng)激刺激而過(guò)量表達(dá)。迄今已在非洲瓜蟾、牛蛙、大鼠、小鼠和人類(lèi)的某些細(xì)胞類(lèi)型，實(shí)驗(yàn)性證實(shí)CIRP在冷應(yīng)激條件下的細(xì)胞保護(hù)作用，對(duì)理解人和動(dòng)物冷應(yīng)激調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的意義。推測(cè)豬卵母細(xì)胞在低溫條件下，也會(huì)產(chǎn)生CIRP表達(dá)的變化，但其具體作用仍需要實(shí)驗(yàn)證明。本試驗(yàn)選用先前報(bào)道較多的32℃和室溫25℃作為冷應(yīng)激處理溫度，研究冷應(yīng)激對(duì)體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞成熟率、受精率和發(fā)育能力的影響;研究冷應(yīng)激處理對(duì)卵母細(xì)胞微管、微絲等

5、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的影響;并通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)CIRP mRNA的表達(dá)規(guī)律，初步分析其在冷應(yīng)激條件下的細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制。試驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下。
　　1.冷應(yīng)激對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟與發(fā)育的影響
　　抽吸法采集卵巢卵母細(xì)胞后，以38.5℃培養(yǎng)條件作為對(duì)照，試驗(yàn)組則分別在32℃和25℃環(huán)境溫度下放置30 min，1h和2h。雙醋酸熒光素(FDA)染色檢查各組卵母細(xì)胞存活率，體外成熟培養(yǎng)44h后根據(jù)第一極體(pbI)排出情況統(tǒng)計(jì)成熟率

6、，成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，比較各組體外受精卵裂率和囊胚發(fā)育率。結(jié)果表明，冷應(yīng)激刺激后各組卵母細(xì)胞存活率未表現(xiàn)出顯著差異;冷應(yīng)激處理對(duì)卵母細(xì)胞成熟率和體外受精卵裂率的影響也不顯著;32℃2h(9.21％)和25℃2h(9.71％)處理組的囊胚發(fā)育率明顯下降(P＜0.05)，其他各組的囊胚發(fā)育率差異不顯著(P＞0.05)。
　　2.不同保存液對(duì)卵母細(xì)胞冷應(yīng)激處理后發(fā)育能力的影響
　　室溫(25℃)條件下，將豬GV期卵母細(xì)胞分別

7、在TCM199培養(yǎng)液（不添加半胱氨酸、豬卵泡液和促性腺激素）和pFF（豬卵泡液）中放置0.5、2、6、12和24h，轉(zhuǎn)至38.5℃培養(yǎng)44h，觀察卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)形態(tài)變化，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率、孤雌激活卵裂率和囊胚發(fā)育率，觀察不同保存液對(duì)豬卵母細(xì)胞冷應(yīng)激處理后體外發(fā)育能力的影響。結(jié)果顯示，TCM199較pFF更有利于冷應(yīng)激條件下豬卵母細(xì)胞的保存;冷應(yīng)激處理后，pFF組卵丘細(xì)胞出現(xiàn)大量脫落，胞質(zhì)顏色變淺;TCM199處理6、1

8、2、24 h后的成熟率(57.3％、58.0％和55.0％)較對(duì)照組(77.4％)有顯著下降(P＜0.05)，而pFF處理6、12、24 h后的成熟率（51.1％、52.9％和48.8％）有極顯著下降(P＜0.01)。卵裂率除pFF24 h處理組外無(wú)顯著變化，但囊胚發(fā)育率變化較大，冷應(yīng)激處理6、12和24 h組中，TCM199組囊胚發(fā)育率（11.4％、10.3％和12.1％）均較對(duì)照組(22.2％)有明顯下降(P＜0.05)，而pFF組

9、的囊胚發(fā)育率分別為4.4％、0％和0％(P＜0.01)。
　　3.豬卵母細(xì)胞冷應(yīng)激條件下細(xì)胞骨架的變化
　　對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞進(jìn)行不同溫度（32℃和25℃）和不同時(shí)間(0、0.5、1和2h)的冷應(yīng)激處理，體外成熟培養(yǎng)44 h，收集成熟卵母細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光染色和激光共聚焦顯微成像技術(shù)，觀察溫和低溫刺激對(duì)卵母細(xì)胞染色體、紡錘體及微絲形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的影響。結(jié)果表明，卵母細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化與冷應(yīng)激時(shí)間有關(guān)。32℃2h和25℃2h組染

10、色體、紡錘體正常比例（51.43％和53.57％）顯著低于對(duì)照組(77.17％; P＜0.05)，其余各組差異不顯著(P＞0.05)。25℃2h組微絲正常比例(76.78％)較對(duì)照組(90.22％)有顯著下降(P＜0.05)，其余各組差異不顯著。
　　4.冷應(yīng)激對(duì)豬卵母細(xì)胞CIRP表達(dá)的影響
　　豬GV期卵母細(xì)胞于32℃分別放置0、0.5、1、2、4、6、8、10和12h，用熒光定量PCR檢測(cè)CIRP mRNA表達(dá)的變化，并

11、比較不同冷應(yīng)激溫度(32℃2h與25℃2h）間的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，冷應(yīng)激可使豬卵母細(xì)胞CIRP mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，且在一定范圍內(nèi)隨冷應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的降低而增加，32℃處理4h時(shí)其表達(dá)量最大，超過(guò)4h后隨冷應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低;冷應(yīng)激處理2h時(shí)，25℃時(shí)CIRP mRNA表達(dá)較32℃略有降低，但無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　5.CIRP在豬卵母細(xì)胞冷應(yīng)激反應(yīng)中的作用
　　豬GV期卵母細(xì)胞

12、在32℃冷應(yīng)激條件下處理0、2和6h，檢測(cè)各組卵母細(xì)胞CIRP、Bcl-2和SOD-1 mRNA表達(dá)的變化，分析冷應(yīng)激條件下CIRP mRNA表達(dá)與Bcl-2和SOD-1 mRNA變化的關(guān)系。結(jié)果表明，CIRP mRNA表達(dá)與Bcl-2和SOD-1 mRNA表達(dá)間存在有相關(guān)性，Bcl-2和SOD-1 mRNA表達(dá)量隨CIRPmRNA的升高而升高;CIRP mRNA表達(dá)降低時(shí)，Bcl-2和SOD-1 mRNA的表達(dá)也隨之下降。表明冷應(yīng)激條