大腸桿菌血清抗體與硫酸慶大霉素偶聯(lián)構(gòu)建抗體靶向藥物的研究.pdf

1、近年來，治療腫瘤的抗體藥物研發(fā)取得了突破性的進(jìn)展，抗體藥物成為生物技術(shù)藥物領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。腫瘤抗體靶向藥物主要是應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)的原理構(gòu)建腫瘤抗體藥物，將治療腫瘤的藥物與抗體結(jié)合，構(gòu)建“生物導(dǎo)彈”，對(duì)腫瘤實(shí)施生物療法。而應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)的原理構(gòu)建抗菌藥物，將抗菌藥物與抗體結(jié)合，構(gòu)建“生物導(dǎo)彈”，對(duì)病原菌實(shí)施“精確打擊”的研究，卻至今沒有報(bào)道。為構(gòu)建針對(duì)大腸桿菌的靶向性硫酸慶大霉素，本文進(jìn)行了如下研究： 1．大腸桿菌血清抗體與聚乙

2、二醇和硫酸慶大霉素復(fù)合物的制備 為了探討大腸桿菌抗血清能否與硫酸慶大霉素結(jié)合，以及結(jié)合后是否會(huì)影響硫酸慶大霉素的藥效和大腸桿菌血清抗體的生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)首先采用豬大腸桿菌滅活油乳佐劑苗，多次多部位背部皮下注射健康家兔，心臟采血，采集超免血清，用ELISA方法對(duì)抗豬大腸桿菌血清進(jìn)行檢測(cè)，其超免血清的抗體效價(jià)高達(dá)1：2048。然后對(duì)二者的結(jié)合條件進(jìn)行摸索，以不同濃度的硫酸慶大霉素、免疫血清、PEG，建立方陣試驗(yàn)。收集各試驗(yàn)組血清抗

3、體與硫酸慶大霉素結(jié)合產(chǎn)生的沉淀物進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳、革蘭氏染色、電鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物與血清抗體結(jié)合良好，以硫酸慶大霉素800(mL)：免疫血清4(μg)：PEG18(g)的結(jié)合量最大。因此，血清抗體與硫酸慶大霉素的結(jié)合具備有效性和可行性。 2．大腸桿菌血清抗體與PEG6000和硫酸慶大霉素復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究 為了探討了結(jié)合物的結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)合物進(jìn)行了紅外掃描和紫外吸收光譜測(cè)定，結(jié)果顯示：結(jié)合物是以PEG6000為中間媒

4、介。血清抗體與，硫酸慶大霉素先分別與PEG6000結(jié)合，從而形成血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素復(fù)合物。結(jié)合的方式是氫鍵。PEG6000主要與血清抗體的酰胺鍵結(jié)合。 3．大腸桿菌血清抗體與PEG6000和硫酸慶大霉素復(fù)合物的靶向性研究 為了探討結(jié)合物的靶向性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)合物進(jìn)行間接ELISA、熒光染色和免疫電鏡檢測(cè)。間接ELISA結(jié)果表明：二者的結(jié)合對(duì)抗體的生物學(xué)活性和免疫學(xué)功能不會(huì)產(chǎn)生抑制作用；熒光抗體染色結(jié)果表

5、明：硫酸慶大霉素、大腸桿菌血清抗體和PEG6000結(jié)合物具有大腸桿菌特異靶向性。硫酸慶大霉素、大腸桿菌血清抗體和PEG6000結(jié)合物與大腸桿菌菌液混合4min后，硫酸慶大霉素、大腸桿菌血清抗體和PEG6000結(jié)合物能與大腸桿菌結(jié)合。硫酸慶大霉素、大腸桿菌血清抗體和PEG6000結(jié)合物與大腸桿菌菌液混合7min后，硫酸慶大霉素、大腸桿菌血清抗體和PEG6000結(jié)合物能進(jìn)入大腸桿菌菌體內(nèi)；由膠體金免疫電鏡結(jié)果中，在大腸桿菌的菌體內(nèi)外均可見到

6、膠體金顆粒，證明結(jié)合了藥物的抗體的仍能高效與大腸桿菌作用，有較強(qiáng)的靶向作用。 4.大腸桿菌血清抗體與PEG6000和硫酸慶大霉素復(fù)合物藥動(dòng)學(xué)檢測(cè)及安全性評(píng)價(jià) 本實(shí)驗(yàn)還探討了結(jié)合物在動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)并對(duì)其進(jìn)行了安全性檢測(cè)。結(jié)果表明：血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素結(jié)合物在家兔體內(nèi)的生物半衰期t<,1/2>為4.83 h，藥-時(shí)曲線下面積AUC為191.41 h.μg/mL，硫酸慶大霉素結(jié)合物在家兔體內(nèi)的生物半衰期為t

7、<,1/2>1.03 h，AUC為63.42 h.μg/ml，這表明血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素結(jié)合物藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布發(fā)生了明顯變化，藥物代謝速度大大減慢，有效血藥濃度時(shí)間延長(zhǎng)，與脂質(zhì)體緩釋劑的特點(diǎn)相似。由于血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素結(jié)合物毒性很低，對(duì)小鼠的最大耐受量大于750mg/kg.bw，此量相當(dāng)于臨床用量的150倍。結(jié)果表血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素結(jié)合物的毒性顯著低于硫酸慶大霉素，表明血清抗

8、體-PEG6000有降低藥物毒性的作用。血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素結(jié)合物對(duì)小鼠重要臟器的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯影響。 5.大腸桿菌血清抗體與PEG6000和硫酸慶大霉素復(fù)合物的藥效學(xué)研究 為了研究結(jié)合物的藥效學(xué)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用結(jié)合物進(jìn)行了體外抗菌試驗(yàn)、大腸桿菌病動(dòng)物模型治療試驗(yàn)。 體外抑菌試驗(yàn)表明：靶向慶大霉素對(duì)大腸桿菌C<,44103>的最低抑菌濃度約為硫酸慶大霉素的1/10<'5>。靶向硫酸慶大霉素對(duì)大腸桿菌

9、C<,44103>的最低殺菌濃度約為硫酸慶大霉素的1/10<'4>。體外抑菌實(shí)驗(yàn)說明將硫酸慶大霉素與大腸桿菌血清抗體和PEG6000結(jié)合后可增強(qiáng)抗菌效果，減少使用劑量，提高療效。 動(dòng)物模型治療試驗(yàn)表明：用高濃度靶向慶大霉素注射液每次肌注1.0mL/只，一次用藥后的有效率、治愈率分別為100％和90％；用中等濃度靶向慶大霉素注射液每次肌注1.0mL/只，一次用藥后的有效率、治愈率分別為100％和75％；用低濃度靶向慶大霉素注射液每

10、次肌注1mL/只，一次用藥后的有效率為100％，治愈率為65％。而硫酸慶大霉素對(duì)照組用硫酸慶大霉素注射液每次肌注1.0mL/只，后發(fā)病小白鼠治療無(wú)效或全部死亡；血清對(duì)照組也治療無(wú)效。靶向慶大霉素注射液對(duì)小白鼠大腸桿菌病療效顯著。 復(fù)合物治療仔豬黃痢臨床治療試驗(yàn)表明：靶向慶大霉素注射液能迅速殺死仔豬體內(nèi)的致病菌，減輕臨床癥狀，提高仔豬成活率。與硫酸慶大霉素相比較，用高劑量靶向慶大霉素注射液每次肌注2.0mg/Kg，一次用藥后發(fā)病仔

11、豬的有效率、治愈率均為100％；用中劑量靶向慶大霉素注射液每次肌注0.2mg/Kg，一次用藥后發(fā)病仔豬的有效率為100％，治愈率為96％；用低劑量靶向慶大霉素注射液每次肌注0.02mg/Kg，兩次用藥后發(fā)病仔豬的有效率為96％，治愈率為92％；而用硫酸慶大霉素注射液每次肌注2.00mg/Kg，每天2次，連用3d后發(fā)病仔豬的有效率為84％，治愈率為76％；且用高劑量靶向慶大霉素注射液、中劑量靶向慶大霉素注射液、低劑量靶向慶大霉素注射液治療

12、的仔豬體內(nèi)致病菌減少速度均要比硫酸慶大霉素注射液快得多。抗血清與慶大霉素結(jié)合物注射液能有效殺滅致病性大腸桿菌，對(duì)仔豬黃痢病有很好的臨床療效。 復(fù)合物治療雞大腸桿菌病臨床治療試驗(yàn)表明：抗血清與慶大霉素復(fù)合物各劑量組給藥1d，病雞病癥均明顯減輕，高劑量組第2d雞停止死亡，雞的食欲和精神基本恢復(fù)；中劑量組治療效果與高劑量組的治療效果基本一致；低劑量組第2d雞停止死亡，腹瀉癥狀基本消失，雞的食欲與精神狀態(tài)第3d也基本恢復(fù)。硫酸慶大霉素組

13、給藥第2d癥狀開始減輕，到第4d腹瀉癥狀基本消失，食欲和精神狀態(tài)到第5d恢復(fù)。從上表數(shù)據(jù)可以看出：抗血清與慶大霉素結(jié)合物注射液高、中、低三種劑量對(duì)雞大腸桿菌病療效顯著，有效率和治愈率分別為100％，100％，92％；100％，100％，90％。而硫酸慶大霉素組的有效率和治愈率分別為80％；70％。就癥狀變化情況看，抗血清與慶大霉素結(jié)合物各劑量組給藥后腹瀉癥狀改善速度和雞的精神狀態(tài)恢復(fù)速度較快，和硫酸慶大霉素組相比能更快地改善雞腹瀉癥狀和