虎杖愈傷組織培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物含量的研究.pdf

1、虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Z.)為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)多年生灌狀草本,主要分布于我國(guó)中部及南部地區(qū)?；⒄纫云涓稍锔透o入藥,其性微寒,味微苦,具有清熱利濕、散瘀定痛、通便解毒、止咳化痰等功效是一味傳統(tǒng)中草藥。臨床上用于治療肝膽疾病,肺熱咳嗽,瘡癰腫毒以及燙傷燒傷,急性細(xì)菌性痢疾以及各類炎癥。其主要成分大黃素(emodin)具有抗炎、抗衰老、抗腫瘤、降血壓和抑

2、制心肌運(yùn)動(dòng)的缺血等多種藥理作用,因而大黃素含量的高低是判斷虎杖藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的標(biāo)志性成分。
　　由于虎杖有著較大的藥用價(jià)值,故此引起了廣泛的關(guān)注。但虎杖的活性成分含量較低,而對(duì)有效成分的大量需求導(dǎo)致對(duì)虎杖藥材資源的過度開發(fā);再加上傳統(tǒng)中藥使用的是虎杖的根和莖,因而為了獲取藥用部位,往往要以犧牲植物整株為代價(jià),這就造成了對(duì)虎杖藥材資源的極大浪費(fèi)。長(zhǎng)此以往勢(shì)必會(huì)破壞植物資源的儲(chǔ)備,對(duì)生態(tài)環(huán)境和該物種的生存都帶來了很大的威脅。因此急需發(fā)展

3、一些新的方法和途徑對(duì)虎杖藥用資源進(jìn)行更有效、更合理的開發(fā)與利用。
　　本課題運(yùn)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)(plants callus culture),利用薄層層析法(thin-layer chromatography,TLC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)和設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)等方法,考察了不同外植體,碳源、氮源的種類和配比,有機(jī)添加物的種類及激素的濃度和配比等因素對(duì)虎

4、杖愈傷組織生長(zhǎng)及其大黃素含量的影響,建立了虎杖愈傷組織的生長(zhǎng)曲線(growth curve)并考察了繼代次數(shù)對(duì)虎杖愈傷組織生長(zhǎng)及其大黃素合成的影響。通過對(duì)虎杖愈傷組織生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物大黃素合成積累的規(guī)律進(jìn)行的相關(guān)研究,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.以MS+6-BA0.2 mg·L-1+KT0.2 mg·L-1+2,4-D0.5 mg·L-1為培養(yǎng)基,分別以虎杖幼嫩的葉片、莖段、葉柄為外植體,通過運(yùn)用薄層層析法和高效液相色譜法對(duì)愈傷組

5、織中所含大黃素進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn):三種外植體均可成功誘導(dǎo)出愈傷組織,且莖段是誘導(dǎo)愈傷組織的良好外植體,不僅誘導(dǎo)率高、誘導(dǎo)時(shí)間短并且大黃素的含量也較高。
　　2.虎杖愈傷組織的生長(zhǎng)曲線基本呈S形。在24 d左右,大黃素的含量達(dá)到最高峰,此時(shí)生物量也處于較高水平,可對(duì)愈傷組織進(jìn)行收獲或繼代。
　　3.3 g·L-1的葡萄糖為較理想的碳源,可有效促進(jìn)虎杖愈傷組織的生長(zhǎng)和大黃素含量的積累;當(dāng)總氮濃度為60 mmol·L-1,且

6、NH4+:NO3-=1:2時(shí),可提高愈傷組織的生物量和大黃素的含量;添加了牛肉膏的培養(yǎng)基可顯著促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)和大黃素的積累;光照12 h/d有利于愈傷組織生長(zhǎng)量和大黃素含量的增加。當(dāng)6-BA為2.5 mg·L-1,KT為0.2 mg·L-1,2,4-D為0.5 mg·L-1時(shí),可明顯提高愈傷組織中大黃素的含量。
　　4.通過對(duì)虎杖第3代至第12代愈傷組織的生長(zhǎng)量及大黃素含量的連續(xù)測(cè)定,其結(jié)果表明:從第5代起虎杖愈傷組織的生長(zhǎng)量

7、和大黃素的含量基本保持穩(wěn)定,可對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　結(jié)論:外植體、碳源和氮源的種類與配比、有機(jī)添加物和生長(zhǎng)激素的配比對(duì)虎杖愈傷組織生長(zhǎng)及其大黃素含量的影響均有一定的影響。在實(shí)驗(yàn)條件下,以莖段為外植體,3 g·L-1的葡萄糖為碳源,加入0.5 mg·L-12,4-D、2.5 mg·L-16-BA、0.2 mg·L-1KT和200 mg·L-1牛肉膏,在光照12 h/d的條件下,培養(yǎng)25 d對(duì)愈傷組織進(jìn)行收獲,可獲得較大的愈傷組織生