機械牽張力對成骨樣細(xì)胞影響的糖蛋白組學(xué)的初步研究.pdf

1、機械力學(xué)刺激作為正畸牙周組織改建重要的生物調(diào)節(jié)因素在骨形成和骨重塑中發(fā)揮重要作用。正畸矯治錯合畸形的基本原理正是利用矯治器作用于牙齒，使得機械力通過牙體硬組織、牙周膜傳遞至牙槽骨，引起牙槽骨組織重塑，牙齒因此移動到新位置。適宜的機械刺激可通過影響成骨細(xì)胞的增殖活性、表型蛋白的表達(dá)和功能促進(jìn)骨生長與骨重塑。糖蛋白組學(xué)方法為全面分析機械力學(xué)刺激對骨重塑翻譯后修飾、揭示參與骨形成和骨重塑的糖蛋白提供技術(shù)支持。為深入研究其機制，我們以糖蛋白組學(xué)

2、為技術(shù)平臺，通過篩選差異蛋白研究力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要蛋白質(zhì)，為應(yīng)力刺激下骨重塑機理的深入研究提供依據(jù)。
　　本實驗通過Flexcell應(yīng)力加載系統(tǒng)，對人成骨樣細(xì)胞（MG-63）施以不同加載時間的周期性牽張力，采用凝集素芯片技術(shù)分析在不同加載時長情況下成骨樣細(xì)胞糖鏈變化，并對差異糖鏈的相關(guān)糖蛋白進(jìn)行分離富集及質(zhì)譜鑒定，明確應(yīng)力刺激骨重塑中差異表達(dá)的糖蛋白，分析差異糖蛋白受應(yīng)力刺激在骨重塑中的作用，為后續(xù)的研究提供依據(jù)：
　　1．機

3、械牽張力對成骨樣細(xì)胞糖蛋白糖鏈的影響
　　目的：研究機械牽張力對人成骨樣細(xì)胞MG-63糖蛋白糖鏈表達(dá)的影響。
　　方法：以Flexcell細(xì)胞應(yīng)力培養(yǎng)系統(tǒng)對人成骨樣細(xì)胞MG-63施以形變率為12％，加載時長分別為4h、8h、12h、24h的周期性機械牽張力，利用凝集素芯片技術(shù)篩選出糖蛋白糖譜中差異表達(dá)的糖蛋白糖鏈，比較不同載荷時間對成骨樣細(xì)胞糖鏈的影響。
　　結(jié)果：8小時實驗組表達(dá)差異最明顯，在加力后實驗組凝集素Jac

4、alin、RCA120、LEL、GSL-I、DBA、VVA、ACA的親和作用增強，而對凝集素WFA、EEL、AAL、LCA、STL的親和作用減弱，提示在機械牽張力作用下成骨樣細(xì)胞表面可能出現(xiàn)增多的黏蛋白T/Tn抗原、I-抗原、N-乙酰半乳糖胺（包括α1-3鏈接方式）、α及β鏈接半乳糖結(jié)構(gòu)，而巖藻糖α1-2鏈接半乳糖、核心巖藻糖、N-乙酰葡糖胺等結(jié)構(gòu)減少。
　　結(jié)論：本文通過凝集素芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)力學(xué)刺激下成骨樣細(xì)胞糖鏈變化與時間呈

5、相關(guān)性，推測在加載4小時后成骨樣細(xì)胞便出現(xiàn)對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)修飾，在加載8小時后成骨樣細(xì)胞半乳糖型糖蛋白明顯增加，細(xì)胞已具備了某些骨化的早期表現(xiàn)。為研究骨改建信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生機制提供了糖組學(xué)理論支持。
　　2．不同應(yīng)力成骨樣細(xì)胞的半乳糖型糖蛋白的分離純化
　　目的：利用以瓊脂糖微粒為固定載體的凝集素親和技術(shù)，對不同加載時長后的成骨樣細(xì)胞蛋白樣品進(jìn)行糖蛋白的分離富集，為下一步質(zhì)譜分析做準(zhǔn)備。
　　方法：以結(jié)合榴蓮凝集素（J

6、acalin）及蓖麻凝集素（RCA120）的瓊脂糖微粒為載體對成骨樣細(xì)胞的空白組、8h和24h實驗組蛋白樣品進(jìn)行半乳糖型糖蛋白的分離富集。在富集時固定化的凝集素與特定的糖蛋白結(jié)合，非結(jié)合部分則被洗脫。凝集素與之后洗脫液中的半乳糖競爭性結(jié)合，將糖結(jié)合物從固定化的凝集素上移除并收集。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證分離效果。
　　結(jié)果：SDS-PAGE電泳顯示瓊脂糖-凝集素親和層析技術(shù)可實現(xiàn)復(fù)雜蛋白質(zhì)較好的分離。
　　結(jié)論：利用瓊脂糖

7、微粒做固定化載體，在富集糖蛋白過程中去除非糖蛋白和糖蛋白中的非半乳糖型糖蛋白，降低了樣品的復(fù)雜性，具有較好的有效性和特異性，為復(fù)雜樣品的蛋白糖基化研究提供基礎(chǔ)。
　　3．機械牽張力作用下成骨樣細(xì)胞差異糖蛋白的質(zhì)譜分析
　　目的：用液相色譜質(zhì)譜技術(shù)檢測不同機械牽張力條件下成骨樣細(xì)胞蛋白差異表達(dá)。根據(jù)鑒定結(jié)果推測成骨樣細(xì)胞的差異糖蛋白如何對機械牽張力刺激做出響應(yīng)。
　　方法：將實驗二中富集后的糖蛋白樣品進(jìn)行酶解脫鹽，之后使

8、用液相色譜（LC）分離蛋白質(zhì)，LTQVelos?質(zhì)譜儀進(jìn)行多肽碎片的掃描鑒定并用BIOWORKS軟件搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。最后得到機械牽張力刺激骨重塑相關(guān)的差異糖蛋白。
　　結(jié)果：鑒定出24個差異表達(dá)糖蛋白，其中4個為空白組成骨樣細(xì)胞表達(dá)升高的糖蛋白，20個為實驗組表達(dá)升高的糖蛋白。差異表達(dá)的糖蛋白主要參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞骨架、信號傳導(dǎo)及能量代謝等多個生命活動過程。
　　結(jié)論：力學(xué)刺激成骨樣細(xì)胞引發(fā)特征蛋白的功能改變，引起細(xì)胞增殖